健脾解毒方對大腸癌細胞mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

施利，毛丹，張紹釩，黃建華，劉新義，張英進，雷三林，馬進安，向大雄，胡春宏，張四方*

（1.中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南長沙410008，2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院,湖南長沙410028）

健脾解毒方對大腸癌細胞mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

施利1，毛丹1，張紹釩1，黃建華2，劉新義1，張英進1，雷三林1，馬進安1，向大雄1，胡春宏1，張四方1*

（1.中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南長沙410008，2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院,湖南長沙410028）

目的探討健脾解毒方對大腸癌細胞增殖的影響及可能作用機制。方法采用水提法制作健脾解毒方提取物，利用超高效液相-高分辨飛行時間質(zhì)譜法分析健脾解毒方的主要成分，MTT法檢測健脾解毒方對大腸癌細胞增殖的影響，Graphpad Prism5軟件計算IC50值，流式細胞術檢測細胞周期，Western Blot技術檢測Phospho-mTOR、Phospho-P53和P21的蛋白表達。結果健脾解毒方能夠抑制大腸癌細胞增殖，處理24、48、72 h后四種大腸癌細胞系的IC50值分別為HCT116（6.894、5.668、3.648 mg/mL）、LoVo（14.65、8.737、7.849 mg/mL）、SW48（8.029、7.026、5.740 mg/mL）及HT29（13.06、9.646、8.448 mg/mL）；健脾解毒方使大腸癌細胞周期阻滯在G1期；并能夠下調(diào)Phospho-mTOR蛋白表達（P＜0.05），上調(diào)Phospho-P53和P21蛋白的表達（P＜0.05）,使大腸癌細胞周期阻滯在G1期。結論健脾解毒方可能通過mTOR-P53-P21途徑抑制大腸癌細胞的增殖，這可能是健脾解毒方治療大腸癌的作用機制之一。

健脾解毒方；大腸癌；細胞增殖；半抑制濃度；mTOR

健脾解毒方為湖南省首屆老中醫(yī)師承導師朱偉光教授治療大腸癌的有效經(jīng)驗方，全方由黃芪、白術、西洋參、半枝蓮、甘草等11味藥物組成，具有健脾益氣、清熱解毒之功，隨癥加減在臨床上取得了很好療效[1-2]。本研究采用水提法制作健脾解毒方，利用超高效液相-高分辨飛行時間質(zhì)譜（UPLC-QTOF/MS）法分析健脾解毒方的主要成分，應用MTT法、流式細胞術、Western Blot等技術，探討健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞增殖的影響，并進一步探討其可能的作用機制，為健脾解毒方治療大腸癌的臨床推廣應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)液，美國Corning公司產(chǎn)品；胎牛血清澳大利亞Ausbian公司產(chǎn)品；噻唑蘭美國Genview公司產(chǎn)品；BCA Protein Assay Kit試劑盒上海碧云天生物技術公司產(chǎn)品，NP-40裂解液上海鼎國生物技術有限公司；P-mTOR（phospho s2448）、PP53（phospho s15）及P21抗體美國abcam公司產(chǎn)品；標準品毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Re、芹菜素、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷、甘草酸、白術內(nèi)酯Ⅱ均購自南京森貝伽生物科技有限公司，供定量測定用，HPLC測定質(zhì)量分數(shù)均≥98%；乙腈（色譜純）德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸（色譜純）美國sigma公司。色譜柱為ACQUITYUPLCBEHC18柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm）美國Waters公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱及生物安全柜為中國Heal Force公司產(chǎn)品；SDS-PAGE蛋白電泳儀為上海天能公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為中國Motic公司產(chǎn)品；酶標儀為美國Thermo公司產(chǎn)品；美國Bechman-Coulter流式細胞儀，美國UVP-2000圖像分析系統(tǒng)，美國PHANTOM 4300圖像掃描儀，ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo G2 QTof四級桿飛行時間質(zhì)譜儀美國Waters公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

人大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞和人正常結直腸粘膜FHC細胞（均購自長沙艾佳生物技術有限公司），于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中生長，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細胞貼壁生長鋪滿瓶底達80%以上時常規(guī)消化、傳代、凍存。

1.3 健脾解毒方的制備

健脾解毒方藥材由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所提供，并經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所中藥鑒定研究室謝昭明研究員鑒定。健脾解毒方由中南大學湘雅二醫(yī)院藥劑科劉新義博士制備，具體步驟如下：按比例稱取健脾解毒復方中各組分，浸泡1 h，分別加8倍水和6倍水加熱回流提取，每次2 h，混合后濾過，真空負壓旋轉(zhuǎn)濃縮后分瓶密封，折算成生藥為1 g/mL。

1.4 UPLC-Q-TOF/MS法測定健脾解毒方粗提物中多種有效成分

液相色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm,1.7 μm），0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），使用前超聲脫氣，用0.22 μm微孔濾膜濾過；梯度洗脫程序：流動相0～2 min，95%A；2～40 min，50%A；40～50 min，0A；50～52 min，0A；0～2 min，5%B；2～40 min，50%B；40～50 min，100% B；50～52 min，100%B；流速：0.4 mL/min，柱溫20℃，進樣量1 μL。質(zhì)譜條件：離子源為點噴霧電離源正離子模式（ESI+）,毛細管電壓為1.1 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為100℃，脫溶劑氣溫度為350℃，脫溶劑氣流量為800 L/h，碰撞能量低能量為6 V，梯度高能量為20 V，碰撞氣體為氬氣，掃描時間為0.2 s，質(zhì)譜掃描范圍100～1 200 m/z。

1.5 細胞生存率檢測

采用MTT法檢測健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細胞和人正常結直腸粘膜FHC細胞增殖的影響。分別收集對數(shù)期細胞，接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設置6個復孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h后取出，加入MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測各孔在570 nm處波長的吸光值（OD值），計算平均OD值和細胞生存率。細胞生存率（Cell Viability）=健脾解毒方各濃度組平均OD值/空白對照組平均OD值×100%。實驗重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期

用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細胞，收集對數(shù)期細胞，加入無血清培養(yǎng)液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，孵育24 h使細胞同步化（各組細胞生長至60%融合）。更換細胞培養(yǎng)液，實驗分2組，分別為空白對照組（Con）、健脾解毒方組（JPJD）。繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)干預24 h后，胰酶消化細胞，制成單細胞懸液，配制細胞濃度為1×106/mL，用流式細胞儀測定細胞周期分布百分比，計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)。PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/ M)×100%。實驗重復3次。

1.7 Western Blot檢測蛋白的表達

10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細胞，收集對數(shù)期細胞，加入無血清培養(yǎng)液，接種于50 mL培養(yǎng)瓶中，孵育24 h使細胞同步化（各組細胞生長至60%融合）。更換細胞培養(yǎng)液，實驗分2組，分別為空白對照組和健脾解毒方組，繼續(xù)于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)干預48 h后，收集各組細胞，加入100 μL裂解緩沖液，冰浴放置120 min，期間輕搖振蕩。然后4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液。應用Bradford法檢測蛋白濃度。每孔上樣50 μg，保持各孔蛋白量平衡，加入SDS緩沖液，煮沸5 min，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，用Tris緩沖鹽溶液稀釋脫脂奶粉為5%濃度封閉液，室溫封閉2 h，再加入P-mTOR、PP53及P21抗體（1∶700）4℃孵育過夜，經(jīng)Tris緩沖鹽溶液洗膜3次后，加入相應過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶4 000）室溫孵育1 h，Tris緩沖鹽溶液洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光顯色，凝膠成像儀進行拍照記錄并進行灰度分析。以目的蛋白與β-actin的光密度比值表示目的基因在蛋白水平的表達。實驗重復3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理

運用Graphpad Prism5軟件計算IC50值。采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以“±s”表示，方差齊性時兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UPLC-Q-TOF/MS法檢測到健脾解毒方提取物中7種主要成分

以2015版《中華人民共和國藥典》中對復方中各單味草藥的質(zhì)量控制標準為依據(jù)，我們選取了17個標準樣品并配成混標。分別取混合對照品溶液、供試品溶液各2 μL，按色譜和質(zhì)譜條件進樣，分別得到供試品圖譜和對照品圖譜（見圖1）。依照相應的保留時間和相應的質(zhì)譜信息進行比對，最終鑒定出毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Re、芹菜素、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷、甘草酸、白術內(nèi)酯Ⅱ共7個成分，其詳細質(zhì)譜信息見表1。

圖1 對照品混合物（A）和健脾解毒方（B）的總離子流圖

表1 健脾解毒方提取物7種成分質(zhì)譜信息

2.2 健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞增殖的影響

將健脾解毒方分別設置0、0.05、0.5、5、50、500 mg/mL共6個濃度梯度干預24、48、72h后，采用MTT法計算出健脾解毒方各濃度組細胞生存率值，結果表明4種大腸癌細胞系在5～50 mg/mL濃度區(qū)間細胞生存率值均能達到50%，見圖2(A)。通過Graphpad Prism5軟件計算IC50值，結果顯示，健脾解毒方干預24、48、72 h后，四種大腸癌細胞系的IC50值分別為HCT116（6.894、5.668、3.648 mg/mL）、LoVo（14.65、 8.737、7.849 mg/mL）、SW48（8.029、7.026、5.740 mg/mL）及HT29（13.06、9.646、8.448 mg/mL），提示健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW620及HT29細胞的增殖抑制作用與時間有一定相關性，見表2。采用2倍稀釋法重新設置0、2.5、5、10、20、40 mg/mL共6個濃度梯度分別干預24、48、72 h后，計算出健脾解毒方各濃度組細胞生存率值并繪制出各組細胞生存率的曲線圖，見圖2（B，C和D），提示健脾解毒方對大腸癌細胞系HCT116、LoVo、SW48及HT29的增殖抑制作用與濃度相關。

表2 健脾解毒方對大腸癌細胞不同時間點IC50值的影響（±s，mg/mL）

表2 健脾解毒方對大腸癌細胞不同時間點IC50值的影響（±s，mg/mL）

注：與24 h組比較，*P＜0.05；與48 h組比較，#P＜0.05。

24 h 48 h 72 h 24 h VS 48 h 24 h VS 72 h 48 h VS 72 h HCT116 6.894±0.542 5.668±0.467* 3.648±0.279*#t=6.476 P=0.032 t=28.313 P=0.001 t=8.542 P=0.014 LoVo 14.65±1.142 8.737±0.68* 7.849±0.61* t=21.375 P=0.002 t=21.972 P=0.002 t=2.377 P=0.142 SW48 8.029±0.709 7.026±0.593 5.740±0.435*#t=4.672 P=0.061 t=15.377 P=0.006 t=7.689 P=0.026 HT29 13.06±0.107 9.646±0.765* 8.448±0.671*#t=13.344 P=0.005 t=20.876 P=0.003 t=6.547 P=0.031

圖2 MTT法檢測健脾解毒方對大腸癌細胞增殖的影響

2.3 健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞周期的影響

依據(jù)計算得到的大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞的IC50值結果，設定健脾解毒方的干預濃度分別為HCT116（7 mg/mL）、LoVo（14 mg/mL）、SW48（8 mg/mL）及HT29（13 mg/mL），干預24 h后采用流式細胞儀檢測健脾解毒方對各組細胞周期的影響，結果顯示，與對照組比較健脾解毒方組G1期細胞所占比例明顯上升，S期+G2期細胞比例顯著下降，其增殖指數(shù)也顯著性降低，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。這些數(shù)據(jù)提示健脾解毒方能夠抑制大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞DNA合成并使細胞周期阻滯于G1期，見表3。

表3 健脾解毒方對大腸癌細胞周期的影響（±s，%，n=3）

表3 健脾解毒方對大腸癌細胞周期的影響（±s，%，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

t值P值HCT116 LoVo SW48 HT29 G1 S G2 G1 S G2 G1 S G2 G1 S G2 Con 50.81±4.61 27.91±2.1 14.01±1.2 48.15±4.17 28.03±2.34 15.01±1.23 49.12±4.16 28.01±2.52 14.21±1.71 50.08±4.31 26.91±2.1 14.81±1.31 JPJD 71.12±6.21* 16.21±1.35* 8.31±0.81* 68.17±5.76* 18.01±1.54* 9.54±0.78* 69.12±5.38* 17.61±1.17* 9.23±0.81* 67.21±5.52* 19.02±1.65* 9.72±0.79* -21.986 27.020 25.315 -21.809 21.694 21.054 -28.394 13.343 10.210 -16.818 30.369 16.954 0.002 0.001 0.002 0.002 0.002 0.002 0.001 0.006 0.009 0.004 0.001 0.003

2.4 健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞Phospho-mTOR(P-mTOR)、Phospho-P53 (PP53)和P21蛋白表達的影響

如前所述，同樣設定健脾解毒方的干預濃度分別為HCT116（6 mg/mL）、LoVo（9 mg/mL）、SW48（8 mg/mL）及HT29（10 mg/mL），干預48 h后采用Western Blot法檢測健脾解毒方對mTOR信號通路相關蛋白表達的影響，結果顯示，與對照組比較健脾解毒方組P-mTOR表達水平明顯下調(diào)，PP53和P21表達水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表4及圖3。

表4 健脾解毒方對大腸癌細胞P-mTOR、PP53和P21蛋白表達的影響（±s%，n=3）

表4 健脾解毒方對大腸癌細胞P-mTOR、PP53和P21蛋白表達的影響（±s%，n=3）

注：與對照組比較，*P＜0.05。

t值P值HCT116 LoVo SW48 HT29 P-mTOR PP53 P21 P-mTOR PP53 P21 P-mTOR PP53 P21 P-mTOR PP53 P21 Con 1.32±0.16 0.33±0.03 0.26±0.03 1.51±0.17 0.12±0.01 0.21±0.02 1.55±0.16 0.22±0.02 0.21±0.02 1.53±0.16 0.16±0.02 0.12±0.01 JPJD 0.72±0.08* 0.82±0.07* 0.53±0.06* 0.68±0.07* 0.32±0.04* 0.65±0.07* 0.23±0.02* 0.61±0.05* 0.65±0.07* 0.75±0.08* 0.34±0.04* 0.25±0.03* 12.990 -21.218 -5.892 9.714 -11.547 -8.468 16.331 -9.650 -8.468 16.887 -9.000 -5.629 0.006 0.002 0.028 0.010 0.007 0.014 0.004 0.011 0.014 0.003 0.012 0.030

圖3 HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞兩組P-mTOR、PP53及P21蛋白表達的電泳圖

3 討論

大腸癌是癌癥死亡的主要原因之一，大腸癌的治療方法包括手術、化療、放療及靶向治療等，但是其臨床療效并沒有得到大的改善，手術后5年生存率約60%[2]，出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶后5年生存率約10%[3]，因此找到新的能提高臨床療效的綜合治療方法一直是大腸癌治療的研究熱點。在我國，中醫(yī)藥在大腸癌的臨床治療中有著重要地位[4]。大量臨床研究表明，中醫(yī)藥具有改善臨床癥狀、提高免疫力、結合放化療增敏減毒、減少復發(fā)轉(zhuǎn)移等獨特優(yōu)勢[5]。脾虛氣弱、瘀毒結聚是大腸癌的主要病因病機，治以健脾益氣、清熱解毒為法，已成醫(yī)家共識[6-7]。雖然近年來關于中醫(yī)藥治療大腸癌的療效機制的實驗研究取得較大進展[8]，但是基于健脾解毒立法的中醫(yī)有效方劑的具體作用機制仍不十分清楚。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是PI3K/Akt通路的下游分子。mTOR包括mTORC1和mTORC2兩個復合物，其中mTORC1對雷帕霉素敏感，對各種細胞內(nèi)（能量及應激）和細胞外（營養(yǎng)、生長因子及激素）信號起反應，通過其下游的S6K1和4E-BP1促進蛋白質(zhì)合成，是細胞生長增殖的中心環(huán)節(jié)[9]。mTOR通路可調(diào)控與腫瘤發(fā)生密切相關的細胞惡性轉(zhuǎn)化、生長增殖、周期調(diào)控、侵襲與轉(zhuǎn)移、腫瘤干細胞的形成等多項細胞功能[10]。mTOR信號通路異常與大腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[11]。mTOR已成為抗腫瘤治療的靶點，mTOR抑制劑臨床試驗結果表現(xiàn)出抗腫瘤活性，新的m-TOR抑制劑的臨床試驗仍在進行中[12-13]。

P53基因為抑癌基因，通過調(diào)控細胞周期停滯、凋亡及衰老等途徑起抑制腫瘤的作用[14]。P53基因功能異常與大腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，大約有40%～50%的大腸癌患者P53基因突變[15]。P21是細胞周期依賴性激酶抑制蛋白(CDKs)家族中重要的調(diào)節(jié)因子，促進細胞周期阻滯的主要蛋白[16]。P53在腫瘤細胞周期進程中通過活化轉(zhuǎn)錄P21基因，P21蛋白能抑制CDK磷酸化或Cyclin-CDK的活性使腫瘤細胞停滯在G1期，從而阻滯細胞周期從G1期向S期的進展[17]。mTOR的活化能夠磷酸化P53蛋白的絲氨酸-15位點的磷酸酶（由α-4亞基和PP2A催化亞基組成）從而抑制P53的活性[18]。腫瘤細胞中異常活化的mTOR能夠抑制P53的表達與活性，促進腫瘤異常增殖及腫瘤血管生成，從而使腫瘤細胞獲得永生性[19]。

健脾解毒方由黃芪、白術、西洋參、半枝蓮、甘草等11味藥物組成。元代著名醫(yī)學家劉元素指出黃芪的作用有五：“補諸虛不足，一也；益元氣，二也；壯脾胃，三也；去肌熱，四也；排膿止痛，活血生血，內(nèi)托陰疽，為瘡家圣藥，五也”。健脾解毒方以黃芪益氣健脾解毒，白術健脾益氣利水共為君藥，全方共奏健脾益氣、解毒清熱、利濕消腫之功。我們采用水提法制作健脾解毒方，并利用UPLC-Q-TOF/MS法檢測到了健脾解毒方中7種有效成分：毛蕊異黃酮葡萄糖苷、人參皂苷Re、芹菜素、人參皂苷Rb1、黃芪甲苷、甘草酸、白術內(nèi)酯Ⅱ。現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪提取物毛蕊異黃酮葡萄糖苷能夠通過ERβ/miR-17信號通路促進大腸癌細胞凋亡[20]，黃芪甲苷具有增強免疫、抑制肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用[21]。西洋參提取物人參皂苷可通過多種途徑促進大腸癌細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及進展[22-23]，白術內(nèi)酯Ⅱ能夠誘導黑素瘤細胞周期G1期停滯及細胞凋亡[24]，半枝蓮提取物芹菜素具有誘導大腸癌HCT116細胞凋亡及促進自噬的作用[25]，甘草提取物甘草酸可通過下調(diào)HSP90基因表達誘導人結腸癌HT-29細胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。

本文通過MTT法檢測健脾解毒方對大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞增殖的影響，結果表明，健脾解毒方對4種大腸癌細胞系均有抑制增殖的作用，其抑制效率與濃度呈正相關。我們同時運用Graphpad Prism5軟件計算健脾解毒方干預24、48 h及72 h后的IC50值，結果提示，隨著作用時間延長IC50值下降，其抑制作用增強。說明健脾解毒方的抑制作用與濃度相關并有時間依賴性。健脾解毒方粗提取物對人正常結直腸粘膜FHC細胞增殖沒有影響（數(shù)據(jù)沒有顯示），說明其抑制增殖的作用具有針對大腸癌細胞的特點而對正常結直腸粘膜細胞沒有毒性。

為了進一步明確健脾解毒方抑制大腸癌細胞增殖的具體機制，采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)健脾解毒方能使大腸癌HCT116、LoVo、SW48及HT29細胞周期停滯于G1期。基于mTOR-P53-P21通路在大腸癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，通過檢測P-mTOR、PP53和P21蛋白表達的變化，結果發(fā)現(xiàn)，健脾解毒方能夠下調(diào)P-mTOR蛋白表達，上調(diào)PP53和P21蛋白表達，提示健脾解毒方可能通過在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mTOR的活化，進而促進P53的活化，進一步活化轉(zhuǎn)錄P21基因，促使大腸癌細胞G1期停滯。

綜上所述，健脾解毒方具有抑制大腸癌細胞增殖的作用，其抑制作用與濃度及時間相關，健脾解毒方可能通過mTOR-P53-P21信號途徑抑制大腸癌細胞增殖，這可能是健脾解毒方治療大腸癌的作用機制之一。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Jianpi Jiedu Formula on the Expressions of Proteins Related to mTOR Signal Pathway in Colon Cancer Cell Line

SHI Li1,MAO Dan1,ZHANG Shaofan1,HUANG Jianhua2,LIU Xinyi1,ZHANG Yinjin1,LEI Sanlin1, MA Jin'an1,XIANG Daxiong1,HU Chunhong1,ZHANG Sifang1*
(1.The Second Hospital of Xiangya,Central South University,Changsha,Hunan 410011,China；
2.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410028,China）

ObjectiveTo investigate the effects of Jianpi Jiedu Formula(JPJD)on inhibiting colon cancer cell proliferation capacity and its possible mechanism.MethodsThe main components of water extract of JPJD were analyzed by UPLC-Q-TOF/MS.The effect of JPJD on colon cancer cell proliferation capacity was determined by MTT assays.The IC50value concentration were calculated by Graphpad Prism5 software.The cell cycle was detected by Flow cytometric method.The protein levels of Phospho-mTOR(P-mTOR),Phospho-P53(PP53)and P21 were examined by Western Blot.ResultsMTT assays demonstrated that JPJD can inhibite the colon cancer cell proliferation capacity.The IC50value concentration of JPJDat24h,48hand72haftertreatmentwere6.894,5.668,3.648mg/mLinHCT116cell,14.650,8.737, 7.849 mg/mL in LoVo cell,8.029,7.029,5.740 mg/mL in SW48 cell and 13.06,9.646,8.448 mg/mL in HT29 cell,respectively.JPJD could down-regulate the expression of Phospho-mTOR protein,up-regulate the expression of Phospho-P53 and P21 protein,and keep the cycle of the large intestine cancer cells at G1 phase.ConclusionThe JPJD could inhibit HCT116,LoVo,SW48 and HT29 cells proliferation capacity by mTOR-P53-P21 signaling pathways,and it may be the probable mechanism of JPJD on colorectal cancer.

Jianpi Jiedu Formula;colon cancer;cell proliferation;IC50;mTOR

R285.5；R735.3+4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.12.003

2016-09-01

國家自然科學基金面上項目（81273722）。

施利，女，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結合惡性腫瘤基礎與臨床研究。

*張四方，男，副教授，碩士研究生導師，E-mail:m13308439612@163.com。