柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心肌細胞Cx43的影響

劉建和，王建國，尹萍，楊成龍，唐銀，周正，劉錦霞

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心肌細胞Cx43的影響

劉建和1，王建國2，尹萍2，楊成龍1，唐銀2，周正2，劉錦霞2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南長沙410007；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410208）

目的探討柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心肌細胞間縫隙連接蛋白43（connexin 43，Cx43）表達和分布的影響，為柴胡三參膠囊的臨床應用提供實驗依據。方法大鼠隨機分為空白組、假手術組、模型組、柴胡三參膠囊（青蒿組）、柴胡三參膠囊（常山組）、胺碘酮組、穩心顆粒組，每組各10只。相應干預10 d后，除空白組和對照組外，其余各組采取大鼠左冠狀動脈前降支高位結扎法制作心肌缺血性心律失常模型，再用免疫組織化學S-P法檢測Cx43蛋白在各組大鼠心肌中的表達水平及分布情況。結果柴胡三參膠囊（青蒿組）與柴胡三參膠囊（常山組）Cx43免疫組化灰度值比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，柴胡三參膠囊心律失常評分降低（P＜0.05）、死亡率降低、Cx43平均灰度值增高（P＜0.05）及分布紊亂得到改善。結論柴胡三參膠囊（青蒿）與柴胡三參膠囊（常山）均能夠改善心肌缺血時Cx43的表達及分布，保護心肌，從而減少缺血性心律失常的發生，且柴胡三參膠囊（青蒿）臨床安全性更高。

柴胡三參膠囊；缺血性心律失常；縫隙連接蛋白43;常山；青蒿

缺血性心律失常（ischemic arrhythmias）是冠心病的常見并發癥，是臨床上缺血性心臟病常見的病理生理過程，發病率高，是發生心源性猝死的主要原因，嚴重威脅著人類健康。早期人們對抗心律失常藥物的研究主要集中在膜離子通道上，而其藥物本身又存在致心律失常的風險，且不能有效降低死亡率，致使臨床應用受到限制。而近些年來研究發現縫隙連接（gap junction,GJ）的電脫耦聯與缺血性心律失常密切相關，構成GJ的縫隙連接蛋白43（Cx43）表達和分布的異常是引發缺血后及再灌后心律失常的重要機制。Cx43表達越弱，心律失常的發生率則越高[1]。本研究以目前臨床常用抗缺血性心律失常藥物穩心顆粒和胺碘酮為陽性對照，旨在觀察柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠心肌細胞Cx43表達和分布的影響，進一步探討柴胡三參膠囊抗心律失常的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級Wistar大鼠70只，雌雄各半，體質量（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（湘）2012-0001，動物合格證號（11400700061625，11400700070275）。

1.2 藥物與試劑

柴胡三參膠囊（青蒿與常山均是傳統的抗瘧疾中藥，都具有傳統的抗心律失常作[2-3]，柴胡三參膠囊原配方中含常山，后根據普通高等教育“十一五”國家級規劃教材《中藥學》第二版，常山有毒，故在原有配方不變的情況下，更改常山為青蒿，特在此實驗中分為兩組對比觀察），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室生產提供。柴胡三參膠囊（青蒿）（批號：140403）；柴胡三參膠囊（常山）（批號：140820）；穩心顆粒（山東步長制藥股份有限公司，規格：9 g/袋；胺碘酮[賽諾菲（杭州）制藥，規格：0.2 g/粒]；兔抗Cx43多克隆抗體，北京博奧森生物有限公司提供（批號：K142714C）；抗Gi蛋白抗體，北京中杉金橋生物技術有限公司提供（批號：K142714C）。

1.3 儀器

RWD407型小動物呼吸機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；RM6280型多道生理信號采集處理系統以及圖像識別分析系統（成都儀器廠）；光學顯微鏡（上海瀘星光學儀器有限公司）。

1.4 分組與給藥

將大鼠隨機分為7組：空白組、假手術組、模型組、柴胡三參膠囊（青蒿組）（簡稱：柴三青蒿組）、柴胡三參膠囊（常山組）（簡稱：柴三常山組）、穩心顆粒組、胺碘酮組，每組10只。空白組、假手術組、模型組、柴三青蒿、柴三常山組、穩心顆粒組、胺碘酮組，分別予以生理鹽水（同等容量1 mL）、生理鹽水（同等容量1 mL）、生理鹽水（同等容量1 mL）、柴胡三參膠囊（青蒿）內容物溶液[以70 kg成人劑量4.8 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.014 g/（kg·d）]、柴胡三參膠囊（常山）內容物溶液[以70kg成人劑量4.8 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.014 g/（kg·d）]、穩心顆粒溶液[以70 kg成人劑量27 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.077/（kg·d）]、胺碘酮溶液[以70 kg成人劑量0.6 g/（kg·d）換算，大鼠劑量0.002 g/（kg·d）]灌胃。各組均在結扎冠狀動脈左前降支前10 d預先給藥，連續灌胃10 d。

1.5 動物模型制備

根據文獻[4-6]的Wistar大鼠冠心病氣虛痰瘀模型造模方法稍作改進。末次給藥30 min后，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉老鼠，生物信號采集器全程記錄II導聯心電圖，切開氣管，連接呼吸機。在胸骨左緣縱行切開皮膚，依次分離組織，暴露心臟，分離心包膜，從左心耳下緣處進針，肺動脈旁出針，結扎冠狀動脈左前降支。以II導聯ST段明顯抬高或T波高聳，結扎線以下心臟表面區域顏色變暗為造模成功的標準。結扎30 min后再灌注40 min。（空白組只麻醉不開胸不結扎，假手術組只開胸不結扎。）

1.6 Cx43免疫組化染色與分析

灌注結束后直接摘取心臟（空白組直接開胸摘取心臟，假手術組則直接摘取心臟，經PBS緩沖液沖洗），選取部分左心室心肌組織，用多聚甲醛溶液固定，采取免疫組化染色SP法對取材的左心室組織進行染色（嚴格按照試劑盒說明書操作），在光學顯微鏡下觀察Cx43的表達及分布情況。每張切片隨機選5個高倍視野，以心肌胞漿中棕黃色顆粒狀及位于心肌細胞之間閏盤連接處為Cx43陽性表達，細胞核為淡藍色。最后采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件對上述切片在顯微鏡下的視野進行陽性染色的平均灰度值測定，進而對心肌Cx43的表達進行半定量分析。灰度值越大，Cx43表達越弱，灰度值越小，Cx43表達越強。

1.7 統計方法

所有數據均用SPSS 22.0統計軟件分析，所有數據均采用“±s”表示。計量資料采用t檢驗，方差不齊者換用校正t檢驗；非正態分布采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡情況

在喂養及手術期間，因意外原因死亡（麻醉意外、多次結扎致大出血等）大鼠剔除心電圖統計分析及最后數據統計；因惡性心律失常而死亡的大鼠進入心電圖統計分析，但不進入最后的數據統計。在實驗過程中，因室顫死亡的缺血再灌注模型組4只，死亡率40%；柴三青蒿組2只，死亡率20%；柴三常山組2只，死亡率20%；穩心顆粒組1只，死亡率10%；胺碘酮組4只，死亡率40%。

2.2 每組大鼠室性心律失常評分

采用Curtis和Walker（1988）心律失常評分法對心律失常嚴重程度進行定量分析。實驗缺血再灌注期間，除假手術組因機械性心肌損傷出現短暫室速外，模型組及柴三青蒿組、柴三常山組均有發生多種室性心律失常。與模型組比較，柴三青蒿組、柴三常山組VP、VF發生次數及心律失常評分明顯降低（P＜0.01）（詳見表1）。

表1 缺血再灌注期間各組大鼠心律失常情況及評分（±s）

表1 缺血再灌注期間各組大鼠心律失常情況及評分（±s）

注：與模型組比較，##P＜0.01；與胺碘酮組比較：*P＜0.05。

組別模型組柴三青蒿組柴三常山組穩心顆粒組胺碘酮組F值P值n68896 VP（次）29.20±5.25 4.00±1.69##* 3.11±2.03##* 2.56±2.13##15.60±3.69##4.206＜0.01 VF（次）14.5±3.03 2.63±1.60##* 2.00±1.66##* 1.22±0.97##6.80±1.93##3.257＜0.01 VT（次）41214評分（分）5.40±0.52 1.13±0.03##* 1.67±0.50##* 1.00±0.93##3.60±2.17##0.786 0.638

2.3 Cx43免疫組化染色結果及平均灰度值半定量統計分析

從心肌細胞的縱切面上看，空白對照組和假手術組心肌細胞排列整齊，心肌Cx43表達強陽性，著色均勻，呈明顯的棕黃色顆粒狀，大小一致，條帶狀分布，密集、規律，主要位于閏盤內，界限清晰成線狀排列，大多數位于心肌細胞長軸垂直的端-端連接處，少數位于與長軸平行的側-側相接處以及胞漿內。

在模型組中心肌缺血后心肌細胞呈區域性變性壞死，分布紊亂，心肌細胞腫脹斷裂，心肌纖維斷裂，結構破壞，Cx43表達明顯減弱甚至消失，數量減少，殘存的Cx43界限不清，成點狀或彌散成片，排列散亂，著色斑點大小不一，分布無規律，大部分散亂分布于心肌細胞的胞漿和心肌側面，呈端-端連接處向側-側連接處轉移趨勢。

柴三青蒿組、柴三常山組、穩心顆粒組在心肌缺血后心肌纖維較為整齊，結構破壞較少，Cx43的表達及分布改善，大部分染色顆粒明顯，界限清晰，閏盤處表達多，心肌細胞側-側連接處表達少，分布較為規律。

胺碘酮組心肌缺血后心肌細胞呈大量細胞肥大水腫變性，心肌纖維排列紊亂，Cx43表達較模型組增多，閏盤處可見少量棕黃色顆粒，排列紊亂，分布不規律，心肌纖維的側-側連接處及細胞漿內增多。見圖1。

通過Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件測定陽性染色的平均灰度值進行半定量統計分析可知(如表2)：與空白組及假手術組比較，模型組、柴三青蒿組、柴三常山組、穩心顆粒組、胺碘酮組灰度值增高明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），表明Cx43蛋白在急性心肌缺血心律失常大鼠心肌中表達減弱。與模型組比較，柴三青蒿組、柴三常山組、穩心顆粒組、胺碘酮組灰度值減少，差異有統計學意義（P＜0.01），表明藥物干預可以使Cx43蛋白表達增強，從而減少心律失常的發生。柴三青蒿組、柴三常山組與胺碘酮組比較，其柴胡三參膠囊兩組心肌Cx43免疫組化灰度值減少，有統計學意義（P＜0.05），表明在此實驗中，柴胡三參膠囊（青蒿）、柴胡三參膠囊（常山）較胺碘酮能更好的保護心肌缺血/再灌注大鼠心肌Cx43的表達和分布。柴三青蒿組、柴三常山組與穩心顆粒組比較，其三組的心肌Cx43免疫組化灰度值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。柴三青蒿組與柴三常山組比較，兩組的心肌Cx43免疫組化灰度值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 大鼠缺血區組織形態學變化顯微圖（HE×400）

表2 各組大鼠心肌Cx43灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠心肌Cx43灰度值比較（±s）

注：與空白組及假手術組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與胺碘酮組比較：☆P＜0.05。

組別n心肌Cx43灰度值空白組假手術組模型組柴三青蒿組柴三常山組穩心顆粒組胺碘酮組F值P值10 10 68896 65.33±2.79 68.10±3.43 135.06±2.97△△90.76±3.76△△▲▲☆90.67±3.46△△▲▲☆93.63±2.78△△▲▲115.25±2.65△△▲▲14.379＜0.01

3 討論

缺血性心律失常在臨床中多見，在中醫學屬于“心悸”、“怔忡”范疇。柴胡三參膠囊是本院根據少陽不和且有宿根（宿痰）的中醫病機所制的治療缺血性心律失常的有效驗方，原方主要由柴胡、法夏、黨參、丹參、苦參、黃芩、常山、甘草等藥物組成，其中柴胡為君，調暢氣機、和解少陽之邪，黨參、丹參、黃芩、半夏為臣，以補氣活血以輔正，化痰、活血、清熱、燥濕以驅邪，常山截邪、定悸，甘草補脾益氣、調和諸藥，共為佐使，共奏和解定悸、益氣活血、清熱化痰之效。但常山有毒性，具有強烈的致吐作用，并可致肝、腎的病理損害，臨床用藥具有不安全性。因青蒿[7]和常山具有截瘧定悸的作用，無毒性，臨床用藥安全性大，故特意將常山更改為青蒿，且通過此實驗表明，青蒿與常山在抗心律失常作用上效果無明顯差異，更利于臨床應用。

前期實驗研究[8-11]提示，柴胡三參膠囊(青蒿)可增強缺血性心律失常大鼠心肌細胞SERCA2a活性、減少鈣超載，抗缺血性心律失常；作用于多種離子通道使氯仿、烏頭堿和氯化鋇誘發的心律失常得到抑制；在心肌缺血再損傷模型中能降低乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）以及血清丙二醛（MDA）的含量，升高超氧化物歧化酶（SOD）的含量，提高自由基（OFR）清除劑的活力、增強心肌抗氧化能力、抑制心肌脂質過氧化，從而保護缺血再灌注損傷心肌，有效減少心律失常的發生。

近年來多項臨床研究證實，中藥可通過多靶點、多途徑、多離子通道阻滯和非離子通道調節的整合機制，發揮調節心律失常作用[12-13]。Cx43是構成心肌細胞間通道和縫隙連接的最基本的蛋白質之一,能促進心臟的正常發育，是心肌細胞電耦聯及化學偶聯的基礎，其數量改變可影響心肌的電傳導速度，其分布改變影響心肌的傳導各向異性[14],其構成的離子通道在細胞通訊、心肌缺血再灌注損傷及閏盤重構過程中起著非常重要的作用[15-16]，高表達的Cx43不僅能促進縫隙連接的形成[17],還能有效地降低心律失常的發生機率[18]。

在本實驗研究中，結果表明心肌缺血后Cx43發生了重構，其數量減少、表達減弱，分布紊亂、側邊化，室性心律失常評分、大鼠死亡率也相應的增加，中藥柴胡三參膠囊(青蒿組)與柴胡三參膠囊(常山組)中Cx43表達均較模型組明顯增強，大部分染色顆粒明顯，界限較為清晰，多散在分布于閏盤處，分布紊亂情況得到改善，心律失常評分及大鼠死亡率均較模型組降低。提示柴胡三參膠囊(青蒿組與常山組)均能通過調節Cx43的表達，減少其降解，有效改善Cx43的分布，穩定細胞間的電偶聯，從而維持心肌細胞間正常電活動（即正常的傳導速度及各向異性），減少缺血性心律失常的發生，降低大鼠的死亡率，且柴胡三參膠囊(青蒿組)與柴胡三參膠囊(常山組)對Cx43的表達無明顯差異，在臨床應用柴胡三參膠囊(青蒿組)安全性更高。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effect of Chaihu Sanshen Capsule on Cx43 in Myocardial Cells of Rats with Ischemic Arrhythmias

LIU Jianhe1,WANG Jianguo2,YIN Ping2,YANG Chenglong1,TANG Yin2,ZHOU Zheng2,LIU Jinxia2
(1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;
2.Hunan Uiversity of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Chaihu Sanshen capsule on the expression and distribution of connexin 43(Cx43)of gap junction in myocardial cells of rats with ischemic arrhythmias,and provide experimental basis for clinical applicationofChaihuSanshencapsule.MethodsTheratswererandomlydividedintoblankgroup,shamoperation group,model group,Chaihu Sanshen capsule(Qinghao group),Chaihu Sanshen capsule(Changshan group),amiodarone group and Wenxin granules group,10 rats in each group.After intervention for 10 d,in addition to the blank group and the control group,the other rats were made myocardial ischemic arrhythmias model of left anterior descending coronary artery ligation.The expression and distribution of Cx43 protein miocadial cells of rats was detected by immunohistochemical S-P method.ResultsThe Cx43 gray scale of Chaihu Sanshen capsule(Qinghao group)and Chiahu Sanshen capsule(Changshan group)had no significant difference(P＞0.05).The arrhythmia score of Chaihu Sanshen capsule was lower(P＜0.05)and a decrease in mortality,CX43 average gray value increased(P＜0.05)and distribution disorder to improve.Conclusion Chaihu Sanahen capsule(Qinghao)and Chaihu Sanahen capsule(Changshan)both can improve the expression and distribution of Cx43 in myocardial ischemia cell,protect cardiac muscle and to reduce the incidence of ischemic arrhythmias,and Chaihu Sanshen capsule(Qinghao)shows higher clinical safety.

Chaihu Sanshen capsule;ischemic arrhythmias;Connexin 43;Changshan;Qinghao

R285.5；R541.7

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.12.004

2016-05-06

湖南省科技廳科研項目（2013SK3103）；湖南省中醫藥管理局重點課題（201303）；湖南省重點實驗室開放基金計劃項目（2014XNFZ03）；湖南省科技創新項目投資計劃（[2014]658）；2015年湖南省學位與研究生教育教改研究課題（JG2015B071）。

劉建和，男，醫學博士，教授，主任醫師，博士研究生導師，主要從事中醫藥防治心血管疾病，E-mail:ljh+cm1@163.com。