循環腫瘤細胞在早期肺癌診療中的研究進展

段新春 劉志東 許紹發

世界范圍內，肺癌發病率長期以來居高不下，而且保持成為腫瘤患者死亡的主要原因[1,2]。國內亦然，無論鄉村城市、無論男女，肺癌的發病率和死亡率均排在首位，成為影響社會公眾健康的重大問題[3]。肺癌預后極差，而且70%-75%的患者發現時已處在晚期，失去了手術機會。為此，2011年美國率先開展了國家肺癌篩查試驗（National Lung Screening Trial, NLST），發現低劑量螺旋計算機斷層掃描（low-dose computed tomography,LDCT）可以提高早期肺癌患者的檢出率，進而顯著降低了肺癌患者的死亡率[4]。

隨著國內肺癌篩查指南的制定[5,6]，公眾健康意識的提高，進行LDCT篩查群體日益增加，結果是大量肺小結節的患者被發現、被檢出。但是，肺小結節并不等同于肺癌，相反，90%-95%的病例為良性[4]。為了科學合理地處理該部分患者，多個國家分別制定了肺小結節處理指南[7-9]。此外，醫院設立多學科團隊（Multidisciplinary Team, MDT），主要以胸外科、影像科、呼吸科與腫瘤內科等科室組成肺小結節診療中心，共同提供診療方案。在這過程中，醫生常常依據肺小結節的大小、密度、形態、成分比例、以及特殊征象來判斷其良惡性，對高度懷疑肺癌的患者建議PET-CT檢查、穿刺或者直接手術治療；對難以判斷性質的常依據情況囑咐患者進行3個月-12個月隨訪復查。時間被認為是最好的診斷，然而這些處理策略常常造成過度診療或者延誤治療，讓患者等待復查的同時加劇了患者焦慮心理，反復復查也增加了社會經濟負擔[10]。因此，精準地鑒定肺小結節良惡性成為臨床面臨著的新的機遇與挑戰。

1869年，澳大利亞Ashworth[11]醫生首次提出了CTC的概念。20世紀90年代，人類開始了對CTCs的科研探索，由于檢測技術的限制，早期大部分研究局限在中、晚期腫瘤。但理論上講，超過2 mm的腫瘤便可誘導血管生成，為腫瘤細胞入血提供基礎，有研究[12,13]通過動物實驗驗證了這點，即在腫瘤早期便可在外周血中檢測出CTCs。隨著檢測技術的不斷進步，CTCs檢出的敏感性和特異性也隨之提高[14-17]，因此，CTCs本身的檢測，或者聯合腫瘤標志物輔助影像學檢查有望提高肺小結節良惡性鑒別診斷的準確率。本文主要針對CTCs，以及其在早期肺癌診療方面作一綜述。

1 CTCs的概述

CTCs是指原發腫瘤或轉移病灶內的腫瘤細胞通過主動遷移、侵襲或者外在因素干擾導致其被動脫落，從而進入循環血液所形成[18,19]。有研究[20]表明，1 g腫瘤組織，大約有100萬個腫瘤細胞，便可每日播散腫瘤細胞入血。但是，CTCs的數量在循環血液中常呈現出動態遞減的特點，到達外周血時已十分稀少。據研究，每106個-107個白細胞中才可以檢測到1個腫瘤細胞[21,22]。理論上講，它可以以單個細胞或者以群體細胞組成團塊（circulating tumor microemboli, CTM）[23]進入循環血液，而進入的多少、快慢應主要由腫瘤本身的生物學特性決定，總之，腫瘤細胞進入循環血液是腫瘤本身生存進展的必然結果。

2 CTCs的生物學活性

當病灶中的腫瘤細胞獲得遷移、侵襲的條件與機會時，會主動地下調上皮表型如EpCAM和E-cadherin，上調間葉表型如波形蛋白，通過上皮-間葉轉換（epithelial mesenchymal transitions, EMT）、細胞骨架和細胞間連接緊密程度的改變以增加自身變形、運動的能力，以便順利通過血管[24,25]及淋巴管上皮細胞。進入循環血液的CTCs可表現為以下形式：①凋亡或者壞死。研究[26]表明雖然成千上萬的腫瘤細胞進入循環血液，最終僅僅極少量可以到達遠處臟器。在血流運行的過程中，大量CTCs受到物理剪切力、機械撞擊、及免疫系統攻擊[27]等諸多不利因素從而導致自身凋亡、壞死，同時崩解出ctDNA、RNA[28,29]等其他物質。②存活。雖然CTCs在循環血液中存活時間短，有研究顯示幾小時至24 h不等，但是極少部分CTCs可以存活下來，最終遷移到第二臟器，如在骨髓內形成播散的腫瘤細胞（disseminated tumor cells,DTC）[30]。存活的機制是復雜的，CTCs為了存活，在循環中通過一系列機制去避免自身損毀，如聚集成癌栓避免物理因素帶來的破壞、上調CD47逃逸免疫監視[27]、結合活化的血小板以利于粘附血管內皮細胞，為再次跨越血管內皮創造條件[31]、通過β-globin高表達增強CTCs抗氧化應激的能力[32]等等。③轉移。腫瘤細胞的長期生存需要適宜其生長的微環境，穩定的外周環境是其生存的第一要素。CTCs經過細小的毛細血管時，血流速度緩慢，此時它們可經過間葉-上皮轉化（mesenchymal-to-epithelial transition, MET），或者受到局部炎癥、趨化因子、細胞因子以及黏附分子上調等[33]的影響再次實現跨血管內皮細胞遷移[34]，到達組織器官。骨髓是最常見最容易的定居部位[35]，也因此被稱為DTC的“存儲庫”。定居后的CTCs可能在遷移的過程中失去了某些功能，暫不能分化增值，停留在靜止狀態，稱為臨床休眠腫瘤細胞，這一狀態可持續10年以上[36,37]。休眠的腫瘤細胞呈現異質性的特點，有干性非干性、表型差異之分，其中具有干性的、或中間表型的易于生長增殖[38,39]。這期間它們中的一部分可逃逸免疫清除、抗腫瘤治療[40]，直至自身主動創造再次增值分化的微環境或條件，或者先被動接受促癌因素刺激后再經自身主動增值分化，直到形成影像學可以識別出的微小轉移灶。

3 CTCs的檢測

CTCs在外周血中十分稀少，要從數以千萬計以上背景的細胞中精準地檢測到它們并非易事，這也一直是CTCs科研探索中的瓶頸所在，也是限制其在臨床上發揮作用的主要原因。

3.1 外周血的富集分離 這點通常基于細胞的物理學特性和生物學特性[41]，前者是依據CTCs和正常細胞在大小、密度、電荷等方面的差異設計的，經典的方法如密度梯度離心法[42]、膜過濾法[43]（isolation by size epithelial tumor cells, ISET）、紅細胞變形性富集法[44]、紅細胞電學特征富集法[45]、3D微型過濾器[46]等；后者基于CTCs和正常細胞表面蛋白表達的差異性，利用抗原抗體結合原理所設計，如免疫磁性分離技術法[47]（immunomagnetic separation, IMS）、微流體芯片[48]分離技術法。

3.2 檢測富集分離好的樣本 該步驟主要基于CTCs細胞表面特異性表達分子標記物，采用細胞計數或者核酸檢測的方法，比如CellSearch系統法[47]、配體靶向PCR法[49]（ligand-targeted PCR method, LT-PCR）、插入人端粒酶啟動子和綠色熒光蛋白基因的單純皰疹病毒法（virus trace method, oHSV1-hTERT-GFP）[50]、納米檢測法[51]、流式細胞術[52]（flow cytometry, FCM）、逆轉錄-聚合酶鏈反應法[53]（reversetranscriptase PCR, RT-PCR）等方法。下面主要簡述前三種方法：①CellSearch系統檢測是美國早期發明的一項結合富集分離與檢測為一體，自動化程度較高的技術。這項技術獲得了美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration, FDA）認證，并應用于臨床轉移性乳腺癌、結直腸癌、前列腺癌CTCs的檢測[54]。該技術首先利用腫瘤細胞為上皮細胞這一特性，以包被在磁珠上的上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）抗體與腫瘤細胞表面抗原結合進行富集，其次對富集的樣本進行免疫熒光標記（DAPI, CKPE, CD45），最后，篩選出來的細胞中EpCAM(+)DAPI(+)CK-PE(+)CD45(-)為腫瘤細胞。此法雖然廣泛應用，也獲得許多國家的認可，但是在實踐檢驗中發現其受到EMT效應影響，靈敏性、特異性低成為美中不足之處，尤其在早期肺癌診斷方面。②與CellSearch系統法相對應，國內一項原創檢測技術LT-PCR法在肺癌鑒別診斷中具有較高的靈敏性和特異性[17,55]，其試劑盒也已通過了中國國家食品藥品監督管理局（China Food and Drug Administration, CFDA）的批準上市。該技術原理是基于腫瘤細胞表面表達某種特異性抗體，例如肺癌細胞表面會過量表達葉酸受體（folate receptor,FR），然后以配體類似物交聯核苷酸片段作為檢測探針，與腫瘤細胞表面受體靶向結合，從而將CTCs的數量轉變為探針的數量，最后通過檢測探針的PCR，計算出CTCs的數量。③oHSV1-hTERT-GFP法是國內最新，并擁有自主知識產權的一項CTCs檢測技術，基本原理是依據腫瘤細胞端粒酶高啟動活性，和溶瘤病毒——單純皰疹病毒-1（herpes simplex virus-1, HSV-1）嗜腫瘤特性相結合，將端粒酶啟動子和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）基因插入HSV-1，以HSV-1為載體識別并感染腫瘤細胞，再通過端粒酶啟動子特異啟動基因表達綠色熒光蛋白，最后用流式細胞術檢測和分選CTCs。此法已在6種實體器官腫瘤和淋巴瘤中檢測，顯示出了良好的靈敏性和特異性[50]。此法優勢在于其較好的穩定性和可靠性，所檢測出的腫瘤細胞具有活性，而且可進一步通過單細胞測序等技術獲得細胞與分子層面的信息。

4 CTCs的臨床價值

4.1 CTCs的篩查診斷 目前，LDCT、腫瘤自身抗體[56]、腫瘤標志物等方法在肺癌篩查方面尚不能單獨精準地鑒別良惡性，例如最常應用的LDCT，由于肺小結節在影像學呈現出多樣性的特點，異病同影/同病異影給鑒別良惡性造成很大困難，從而導致較高的假陽性率，過度診斷，同時也可能造成延誤診斷、以及隨訪復查加劇患者焦慮心理、影響患者正常工作生活[10]，此外，它還存在醫源輻射、篩查費用高等弊端。理論上講，早期肺癌患者，甚至在肺內尚未形成微小病灶之前，外周血中已存在CTCs，主要難點在于檢測手段是否可以有效地檢測出CTCs，即靈敏性、特異性的問題。

一項關于168例慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）患者的研究[57]，以每年胸部CT和ISET法檢測CTCs為比較，查看患者COPD有無向肺癌轉變。結果顯示當ISET法檢測出5例患者外周血內存在CTCs時，胸部CT檢查并未發現肺部小結節，此后隨訪監測1年-4年，胸部CT才發現肺部小結節并行手術治療，術后病理均為Ia期肺癌。這項研究顯示出液體活檢的優勢，CTCs的檢測可以早于胸部CT發現非常早期的癌，其輔助影像學檢查有助于提高診斷的準確率，從而早期治療，使術后生存獲益。

CTCs的檢測還有助于鑒別肺結節，尤其是肺小結節的良惡性，包括肺磨玻璃結節（ground-glass nodules,GGNs）。早期國外研究[58]采用CellSearch法對150例患者檢測其有無CTCs，去區別良惡性，結果發現肺癌患者組CTCs陽性率30.6%，非肺癌組12%，CTCs數量在肺癌組顯著高于非肺癌組，但是受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC曲線）分析CTCs檢測并無充分的能力去鑒別良惡性。與前期研究不同，Chen等[59]的研究中，肺癌組與肺部良性疾病、健康者對照組對比表明前者CTCs陽性率84%，后者僅4.2%。國內學者[17,55]采用靶向PCR CTC檢測技術檢測非小細胞肺癌患者（non-small cell lung cancer, NSCLC）與肺部良性疾病患者、健康受試者外周血中有無CTCs，發現肺癌患者與非肺癌患者外周血中CTCs存在顯著差異（P＜0.001），雖然檢出率受分期影響[60]，但是I期NSCLC患者的診斷靈敏性達到67.2%。因此，隨著新技術的開發改進，CTCs的檢測聯合CT檢查有望彌補單純CT檢查在肺部疾病良惡性鑒別中的不足，此外，亦可避免患者接受胸部CT引導下穿刺等有創檢查帶來的風險。

4.2 CTCs的療效評估 早、中期肺癌最有效的治療手段首選手術根治，術后依據病理結果決定是否輔以放、化療、靶向治療以及中醫藥等其他治療。但是，無論分期多少，肺癌患者手術后常常死于復發或轉移。形成這種結局的原因[61]首先的可能是術前已存在未發現的微轉移病灶或者持續性的局部病變，其次的可能是治療本身例如手術、活檢等與病灶接觸性的操作，在某時某種條件下可能引發或促進了CTCs向循環血液中播散，為以后轉移埋下了隱患。2000年相關研究[62]結論已表明相比較于開胸肺葉切除手術，電視輔助胸腔鏡手術（video-assisted thoracic surgery, VATS）在NSCLC患者手術治療中可能會增加腫瘤細胞播散進入循環血液的風險。這種推測原因首先是肺部病變不能直觀可視，需要使用器械或者手指觸摸確定病灶的存在及其位置；其次是因為手術過程中有可能頻繁牽拉病肺，以及其他未知欠規范的操作和主觀因素。雖然入血的CTCs不一定存活、形成轉移灶，但是增加了復發轉移的風險，并且預示著預后不良[63]，這也很有可能是少部分早期肺癌患者術后早期復發轉移的原因之一。

毋庸置疑，VATS是當今胸外科微創手術的主流，尤其在肺癌治療方面，優勢顯著，是最佳選擇的治療手段。但是，如果確實手術中存在一些促使腫瘤細胞入血的因素，那么這些因素應該及時被發現、被理解，并且應當受到積極面對，條件允許的情況下盡量避免，從而完善手術操作，獲得更好的療效。

對于晚期肺癌患者，姑息性治療緩解嚴重的癥狀是最主要的。一項納入了20例晚期肺癌患者，并經過支氣管鏡下冷凍治療解除氣道腫瘤阻塞的研究[64]表明，相比較于治療前的CTCs，治療后75%的患者CTCs增加，在一些患者中增加尤為明顯，因此，治療同時也有可能促進CTCs擴散，形成轉移。

大量研究已顯示CTCs的檢測還可以評估化療方案的可行性和療效的優劣，從而指導化療方案的調整。例如Gorges等[65]研究，采用一種新的體內裝置捕獲CTCs，對比分析含鉑雙藥化療前后患者的CTCs數量變化，結果發現部分緩解（partial response, PR）/完全緩解（complete response, CR）的患者CTCs數量平均下降8.25個，穩定（stable disease, SD）患者無變化，而病情進展（progressive disease, PD）患者平均增加了4.5個，說明CTCs數量的變化可以反映化療的療效。Zhao等[66]采用微流控技術，選擇多種核酸適配體去捕獲CTCs，結果顯示可以實時地反應腫瘤的異質性，獲取比較全面的信息，監測患者對化療敏感性，評估療效，指導治療。此外，CTCs的檢測也可以分析肺癌患者有無EGFR突變[67]、ALK重排[68]，指導個體化靶向治療以及評估靶向治療的耐藥情況。

4.3 CTCs的術后監測與預后判斷 手術治療后的肺癌患者或者系統化治療的肺癌患者，均需要定期復查，監測有無復發或轉移。相比較常規胸部CT檢查，CTCs的檢測可以更早地更準確地反應體內腫瘤活動的情況，因此對術后發現早期復發轉移的意義重大。若在手術后早期檢測出多量CTCs，則有可能表明體內殘留腫瘤細胞過多，結合病理情況制定個體化治療方案可能有益于患者術后長期生存。

目前，臨床上主要依據術后TNM分期、病理類型、腫瘤標志物等來判斷預后，CTCs檢測在判斷預后方面具有靈活性、準確性的特點，如果與前者結合起來判斷會更加科學合理。Chen等[69]以CEA聯合檢測外周血中CTCs來判斷NSCLC患者的預后，結果提示兩者呈正比關系，兩者均高的患者預后更差。有研究[70]采用CellSearch法和ISET法對將行手術根治的NSCLC患者在術前檢測CTCs，結果顯示有CTCs的患者的無疾病生存期（disease-free survival, DFS）比無CTCs的患者的DFS要差，并提出術前CTCs的檢測可以成為判斷術后預后的重要標志物。一項納入20項研究meta分析[71]表明CTCs數量和腫瘤分期、淋巴結轉移有關，和腫瘤類型無關。此外，NSCLC患者中CTCs的存在預示著比較差的總生存時間（overall survival,OS）與無進展生存時間（progression-free survival, PFS）。總之，以上研究均表明，CTCs的檢測有望成為臨床上判斷肺癌預后的有力工具。

5 CTCs檢測的優缺點

CTCs和循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）是液體活檢最主要的部分，也均為目前研究的熱點。ctDNA是指體內的腫瘤細胞凋亡、壞死后釋放入循環血液的DNA片段[29]。相比較于ctDNA，CTCs包括了DNA、RNA、蛋白質等方面的信息，能夠更全面的反應腫瘤，但是在反映腫瘤異質性方面可能遜色于ctDNA。檢測方面，它們均有無創、便捷、可重復性好的優點，但是檢出率低，檢測的靈敏性、特異性低成為限制其發展的瓶頸，究其原因，首先和檢測技術有關；其次和腫瘤類型、腫瘤大小、負荷有關；最后和CTCs、ctDNA的半衰期有關。例如，大量CTCs從原發腫瘤部位進入循環血液，到達外周血，經過毛細血管網、淋巴結、臟器的過濾，再經靜脈回到心臟，反復循環過程中，最后僅僅極少部分（0.02%）可以存活[61]。

6 小結

肺癌的早期診斷、早期治療是提高術后生存率的關鍵，但是現如今單純依據LDCT對早期肺癌的篩查還具有一些問題，利弊還存在爭議，其中最主要的問題是它對大部分肺小結節不能及時有效地鑒別出良惡性。外科手術是早期肺癌最優治療手段，近20年來手術技術日臻成熟，電視輔助胸腔鏡手術（videoassisted thoracic surgery, VATS）下肺葉切除、VATS下精準肺段切除、VATS下解剖性部分肺葉切除與VATS下支氣管袖式肺葉切除等術式精益求精，但是患者仍面臨5年生存率較低的問題，盡管是早期肺癌。這一原因值得去探討，去分析研究。

CTCs作為原發腫瘤的一部分，參與其發生、發展、轉移整個演變過程，并且攜帶其豐富的生物學信息。目前，CTCs進入循環血液后的存活機制、轉移機制尚不清楚，這將可能成為以后研究的重要方向。此外，目前CTCs的檢測以采集外周血，體外檢測為主。這種以“部分血液”的檢測檢出率極低，而且CTCs入循環血液后大量被分散、被破壞。為了避免這些不足，CTCs的檢測可能會從體外檢測向體內檢測發展，比如發明捕獲CTCs的濾網裝置，通過血管介入將其置入到實體瘤器官的主要靜脈，并可以在體外裝置感應其捕獲的情況。隨著CTCs檢測技術的改良進步，它將可能在肺癌患者全程治療過程中扮演重要角色，尤其是對早期肺癌的診斷與治療。