蜜蜂耐寒性及其機理的研究進展

秦 明 王紅芳 劉振國 王 穎 胥保華

（山東農業大學動物科技學院，泰安271018）

蜜蜂耐寒性及其機理的研究進展

秦 明 王紅芳 劉振國 王 穎 胥保華

（山東農業大學動物科技學院，泰安271018）

低溫是影響蜜蜂繁殖情況、分布范圍、擴散速度的關鍵因子。蜜蜂的耐寒性是指蜜蜂耐受低溫的能力，影響蜜蜂耐寒性的因素很多，包括低溫馴化、環境濕度、地理條件等等。針對不同的低溫環境，蜜蜂會采取不同的耐寒策略，主要可以通過降低體內含水量、積累脂類物質等方法提高自身的抗寒能力。因此了解蜜蜂耐寒性及其機理，對于掌握其在當地分布范圍、發生時期和消長動態具有重要意義；亦可根據蜜蜂耐寒機制采取低溫馴化等措施，提高本地越冬蜂群的耐寒性，減少越冬蜂的死亡率，為翌年蜂群春繁奠定良好的基礎。

蜜蜂；昆蟲；耐寒性；耐寒機制

1 前言

耐寒性是指有機體長期或短期暴露在低溫環境下的存活能力，這種存活能力因不同的發育階段、季節因素、遺傳因素、營養因素以及暴露于低溫環境的時間長短而變化[1]。不同昆蟲對于不同的低溫環境，會采取不同的耐寒機制；同種昆蟲的不同個體，不同發育階段的耐寒性也不盡相同。通常昆蟲適應低溫環境的策略有兩類：行為對策和生理對策。前者是通過飛行或者爬行等行為活動尋找避寒保暖的場所，例如在冬天來臨之際通過遷徙或進入土壤等方式來躲避嚴寒；后者則是通過生理生化機制來增強耐寒性能[2]。而蜜蜂則是將兩種對策有效結合起來：首先蜜蜂是一種社會性昆蟲，群居生活，越冬期蜂群聚集成團，達到產熱和保溫的效果；另一方面蜜蜂會啟動自身耐寒系統應對寒冷環境。周冰峰等報道，氣溫低于14℃的花期，中華蜜蜂的出勤數是意蜂的三倍，明顯高于意大利蜜蜂。工蜂采集飛行的最適溫度為18～30℃，氣溫低于9.5℃，意蜂停止巢外活動，低于6.5℃中蜂停止巢外活動。由此可見不同蜂種對于低溫的適應性也有所差異[3]。

2 耐寒機制

不同昆蟲具有不同的耐寒性機制，其主要是通過生態適應和生理生化適應的相互協調，并與昆蟲體內多種化學物質相互作用形成昆蟲耐寒系統。新模式昆蟲蜜蜂，在應對寒冷環境刺激時也不例外，具體主要表現為可通過降低過冷卻點，減少體內含水量，排除體內冰核物質和積累耐寒物質等方式來抵抗凍害[4]。

2.1 降低體內含水量

昆蟲體內含水量是昆蟲準備越冬的信號之一[5]，許多昆蟲在冬季來臨之前會大量脫水，從而引起機體耐寒保護物質積累、血淋巴中溶質成分濃度升高、冰點（freezing point,FP）和過冷卻點（supercooling point,SCP）降低，繼而提高昆蟲耐寒力。與大多昆蟲類似，蜜蜂在寒冷冬季來臨時也會降低體內自由水含量，增加結合水含量的同時減少總含水量。2012年宋修超等人研究發現，變溫貯藏僵蚜對煙蚜繭蜂與恒溫4℃貯藏相比變溫貯藏使煙蚜繭蜂不同程度的降低過冷卻點的同時，其體內的含水量也顯著低于恒溫貯藏[6]；同時比較越冬前后短舌熊蜂耐寒力的變化以及含水量的變化，越冬蜂王的含水量明顯低于處女王，而耐寒力卻顯著提高[7]。Lundheim和Zacharaissen研究發現與耐受結冰型的昆蟲相比，避免結冰的昆蟲體內自由水散失的更快[8]。這表明通過降低體內水分來降低冰點是昆蟲提高自身耐寒性的策略之一，因此，蜜蜂體內游離水分的含量應當作為評價其耐寒性的重要指標之一。

2.2 積累體內脂肪類物質

蜜蜂體內的脂肪含量與其耐寒能力密切相關，總脂肪含量也與過冷卻點呈負相關。其中膜脂類組成成分的季節性變化與在低溫條件下維持膜功能有關。低溫條件下膜成分中的磷脂所含總飽和脂肪酸增加，而不飽和脂肪酸下降[9]。例如，常志光等研究證明：卡尼鄂拉蜂越冬蜂的過冷卻能力與體內游離脂肪酸的含量變化呈正相關，即過冷卻能力隨游離脂肪含量的升高而增強，表明其含量變化影響著越冬蜂的耐寒性[10]；對椰心葉甲嚙小蜂進行短時低溫處理后，蟲體內的脂肪含量由0.08 μg/mg上升到0.11 μg/mg，差異極顯著。因此低溫處理后椰心葉甲嚙小蜂蟲體內脂肪積累，說明脂肪是該蟲的抗寒應答物質之一[11]。但也有研究證明越冬期二化螟幼蟲游離脂肪和結合脂肪含量分別與同期過冷卻點呈正負相關，即過冷卻點隨著游離脂肪酸含量的升高而降低[12]，這兩種截然相反的情況可能與昆蟲的種類不同有關。

2.3 積累小分子耐寒物質

目前已報道的昆蟲體內的小分子耐寒物質包括甘油、山梨醇、甘露醇、五碳多元醇（可能是阿拉伯醇或核糖醇）、海藻糖、葡萄糖、果糖、氨基酸和脂肪酸等[13]。它們不僅在維持細胞膜和生物大分子的結構和功能上具有重要作用，而且可有效降低包括蜜蜂在內的多種昆蟲的過冷卻點，提高其耐寒能力。如梁中貴等研究顯示松阿扁葉蜂(Acantholyda posticalis Matsumura)越冬幼蟲血淋巴內丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸等氨基酸的含量在越冬過程中均明顯增高，證明它們是松阿扁葉蜂在越冬過程中重要的耐寒物質[14]。越冬后赤松毛蟲與越冬前相比，蟲體和血淋巴海藻糖含量分別增加了150.90%和184.18%，山梨醇含量分別比越冬前增加943.07%和643.88%[15]，表明海藻糖和山梨醇等小分子糖在昆蟲耐寒過程中扮演了重要的角色。

2.4 大分子抗凍蛋白的表達

耐寒性物質除了上文提到的小分子物質以外，還有一類重要的大分子物質，即抗凍蛋白[16]。近年來，在一些生物體內發現了各種與昆蟲耐寒性相關的抗凍蛋白（AFP），如熱激蛋白、冰核蛋白、脂蛋白、抗凍蛋白（或稱為熱滯蛋白）。這些影響冰核形成和穩定的蛋白，統稱為冰活性蛋白。其中作為近年來研究熱門的熱激蛋白在鞘翅目昆蟲中了解比較透徹，它是昆蟲在低溫脅迫下誘導產生的，而且在不同冷強度的刺激下表達的熱激蛋白的種類和含量不同，根據分子量以及同源氨基酸序列，可被區分為HSP90、70、60、40以及小分子熱激蛋白(sHSPs)家族，其對于提高新合成的多肽鏈的正確折疊以及防止蛋白質降解有重要作用[17]。抗凍蛋白是一類能夠控制冰晶生長，抑制冰晶之間發生重結晶的蛋白質，可依附到晶核或冰核物質表面，以非依數性形式降低水溶液的冰點和過冷卻點[2]。其中Graham克隆了多種抗凍蛋白的核苷酸序列，并對不同來源的抗凍蛋白進行比較和分析，分離純化了編碼抗凍蛋白分子的cDNA[18]；在膜翅目昆蟲里，麥蛾柔繭蜂在27.5℃和17.5℃溫度條件下，前者Hsp70B4基因明顯高于后者[19]。熱激蛋白家族中不同成員可能對蜜蜂耐熱和耐寒起到的功能不同。張媛英試驗結果顯示中華蜜蜂在4℃時Hsp22.6的相對表達量與在25℃情況下相比呈現上調趨勢，表明Hsp22.6可能在蜜蜂耐寒功能上有一定作用[20]。劉昭華測定中華蜜蜂Hsp24.2的相對表達量在43℃時相對于對照組顯著上調，說明Hsp24.2的高表達明顯提高了中華蜜蜂熱耐受性[21]。與熱激蛋白相比，抗凍蛋白在蜜蜂耐寒研究中還未曾有過相關報道。

3 蜜蜂耐寒性的研究方法

溫度低于蜜蜂體液冰點時，體液仍能保持液體狀態的現象即過冷卻現象。其中過冷卻點是昆蟲耐寒性的一個重要指標[22]，過冷卻現象可以通過其來量化。在溫帶和寒帶地區，凍結溫度通常低于冰點，絕大多數昆蟲可以通過降低過冷卻點的方式增加耐寒力，避免結冰造成傷害。例如隨著緯度的升高，桉樹枝癭姬小蜂的過冷卻點和冰點都呈現降低的趨勢，并且在12月份到3月份其過冷卻點和冰點隨著溫度的升高而升高。同樣在中國長沙地區中華蜜蜂3月份的過冷卻點和冰點顯著低于11月份[23]。李志勇針對越冬期東西方蜜蜂的過冷卻點進行了測試并對其與越冬性能的關系進行了分析。結果發現：在越冬期，東西方蜜蜂存在過冷卻點且二者差異顯著，東方蜜蜂過冷卻點明顯低于西方蜜蜂，相比而言東方蜜蜂表現出對低溫更強的適應性和應變能力，更易抗寒越冬。以上結果表明不同蜂種以及同一蜂種在不同季節的耐寒性能都存在些許差異[24]。總之，蜜蜂可以通過降低過冷卻點，增強自身過冷卻能力，獲得較強耐寒性。

當蜜蜂蟲體溫度低于過冷卻點時，體液開始自發結冰，此時，蟲體耐寒系統開始發揮作用，向外界釋放熱量。通過對釋放的熱量測定，可以方便測出蜜蜂的過冷卻點。根據秦玉川提出的熱敏電阻結合數字萬用電表的方法智能化[25]，現在以低溫恒溫槽為制冷源，用NTC-TD熱敏電阻+數據采集器,可以方便直觀的測出蜜蜂的過冷卻點。此方法擁有靈敏度更高、精簡自動化的優點。國內利用該方法已成功測定了許多昆蟲的過冷卻點，也取得了一定成果。

4 影響蜜蜂耐寒性的因素

4.1 低溫馴化

低溫馴化是指昆蟲在經歷一個較溫和的低溫后，能夠增強抵耐低溫傷害的能力[26]。與在自然條件下，昆蟲在越冬之前都要經歷一個溫度漸變的過程，為其度過寒冷環境做好準備的機理相似。根據低溫下馴化時間的長短，可將其分為長時間的馴化和短時間的馴化兩種[27]。前者主要應對于間接冷傷害和結冰傷害；后者應對于直接傷害和冷休克[28]。在冷馴化后，蜜蜂進入滯育或休眠狀態，體內開始積累甘油和其他小分子耐寒物質（糖，醇）等抗凍保護劑，從而增強了機體的耐凍能力。張燁研究表明馴化時間和溫度交互作用對玉米螟赤眼蜂的冷藏后出蜂情況影響顯著，當15℃馴化10 d后冷藏，出蜂卵數達到峰值為66.75±3.50，其出蜂率為（64.91±2.04）%；當 10℃馴化 20 d后冷藏，出蜂卵數為56.75±4.84，出蜂率達到峰值為（75.50±6.78）%，最佳低溫馴化條件為15℃馴化10 d[29]。曾經也有報道低溫馴化對阿里山潛蠅繭蜂(Fopius arisanus)耐寒性能影響明顯，結果顯示，阿里山潛蠅繭蜂雌雄成蜂SCP、FP均隨馴化時間的延長呈先升高后下降的趨勢，當處理時間為24 h時，雌雄成蜂SCP、FP均達到最高值，與對照差異顯著[30]。可見其他條件不變的情況下，低溫馴化提高了蜜蜂低溫條件下的存活率。

4.2 地理條件

不同地理環境的氣溫變化間接地導致蜜蜂耐低溫性能差別，蜜蜂在長期的進化中形成一種規律性的模式，地理條件對種群擴大其分布有非常重要的生態意義。像高海拔及高緯度地區的蜂種耐寒力較低海拔低緯度地區強很多，即使相同的蜜蜂處在不同緯度其耐寒力也不盡相同。研究表明在低緯度的日本松黃葉蜂卵的SCP為-30.8℃，而在高緯度的愛沙尼亞卻下降-40.6℃。在我國東北地區，本地的蜂群越冬期長達半年，其抵御嚴寒的耐寒能力遠比生活在南方溫暖環境下的蜂群強。

4.3 環境濕度

環境濕度主要包括空氣和土壤等小環境棲息地濕度，這些小環境棲息地濕度對蜜蜂的耐寒性有一定的影響，其主要是通過環境中冰晶對蟲體的接種效應：當蟲體與外界冰接觸時，體內的過冷卻液與冰之間就產生了水蒸氣的壓力差，促使體內的水以蒸汽形式沿孔道外滲，并直接凝聚到冰上,使冰沿孔道向內延伸，當延伸進入體內水相時接種引起體內結冰。Danks等人研究表明，潮濕環境可以使昆蟲過冷卻能力大大降低[31]。

4.4 發育階段

有報道顯示短舌熊蜂幼蟲期耐寒力最低,其次是蛹，工蜂和雄蜂，處女王較高[7]。蜜蜂蟲卵發育的最適溫度范圍約為34～35℃，超出該溫度范圍蟲卵將無法正常發育，而成蜂適溫能力相對較強，在14～40℃的溫度范圍內均能存活。也有報道顯示甜菜夜蛾在低溫條件下的生存能力隨著發育階段的變化而有較大的差別，結果顯示耐寒能力由弱到強的順序分別為卵＜成蟲＜幼蟲＜蛹[32]。上述試驗充分說明處于不同發育階段的蜜蜂，耐寒性可能有所差異。

4.5 其他因素

研究表明，蜜蜂的低溫耐受能力還存在明顯的季節變化，可見季節變遷也是影響蜜蜂耐寒性能的因素之一。除此之外，蜂群群勢、健康狀況、營養儲備、病害感染情況等均是影響蜜蜂耐寒性能的因素。在養蜂生產中，我們經常發現健康蜂群的越冬性能要優于染病蜂群，強群的越冬性能優于弱群，飼料充足的蜂群越冬性能優于缺飼料的蜂群。因此，養蜂人可以根據蜂群群勢、飼料儲備、蜂病等的周年消長情況調節蜂群抗寒性能。

5 應用價值

蜜蜂耐寒性能的高低是影響其繁殖情況、越冬死亡率、分布范圍、擴散速度等的重要因素，掌握蜜蜂耐寒性能及其機制有利于科學判斷蜜蜂的季節性消長動態。在養蜂生產中通過調節營養條件、低溫馴化等能影響蜜蜂耐寒性能的因素，提高本地越冬蜂群的耐寒性，減少越冬蜂的死亡率，為翌年蜂群春繁奠定良好的基礎。

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Research progress on insect resistance to cold and its mechanism

Qin Ming,Wang Hongfang,Liu Zhenguo,Wang Ying,Xu Baohua
(Department of Animal Science and Technology,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018)

Low temperature is the key factor that affects the reproduction,distribution range and diffusion rate of the honey bee.Cold resistance is the ability of withstanding low temperature and there are many factors that affect the cold tolerance of the honey bees,including low temperature acclimation,environmental humidity,geographical conditions and so on.According to different low temperature environment,the bees will adopt different cold resistant strategy,mainly through the reduction of the body water content,accumulation of lipid substances and other methods to improve their ability of cold resistance.Studies on the cold tolerance and its mechanism of bees have important significance in grasping the local distribution,the occurrence period and the dynamics of the growth and decline.At the same time,take measures such as cold acclimation according to the mechanism of cold hardiness,improve cold resistance of local overwintering bees,reduce overwintering mortality,lay a good foundation for the breeding of colony in spring.

honey bee;insect;cold hardiness;mechanism of cold resistance

國家蜂產業技術體系建設專項資金（CARS-45）；山東省農業良種工程項目（2014-2016）

秦明，碩士研究生，研究方向為特種經濟動物飼養與營養，E-mail:736906976@qq.com

胥保華，教授，博士生導師，主要從事蜜蜂科學和動物營養科研工作，E-mail:bhxu@sdau.edu.cn