分子印跡技術在蜂產品中的研究進展（續）

陳長寶劉新迎汪建民牛華星王士強秦浩然尹旭升

(1山東農業大學化學與材料科學學院，泰安271018；2山東省蜂業良種繁殖推廣中心，泰安271000；3山東省獸藥質量檢驗所)

分子印跡技術在蜂產品中的研究進展（續）

陳長寶1劉新迎2汪建民1牛華星3王士強2秦浩然2尹旭升2

(1山東農業大學化學與材料科學學院，泰安271018；2山東省蜂業良種繁殖推廣中心，泰安271000；3山東省獸藥質量檢驗所)

（續《中國蜂業》2017年第7期）

3.2 咖啡酸苯乙酯

咖啡酸苯乙酯是天然存在的一種多酚類化合物，其分子結構中的兒茶酚環是一種常見的自由基清除結構。因此，對菇類資源中咖啡酸苯乙酯的探索以及其抗氧化機制的研究有一定的應用價值。李寧[29]以咖啡酸苯乙酯為印跡分子，4-乙烯吡啶為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，四氫呋喃和異辛烷的混合溶液作為致孔劑合成MIPs。實驗考察了MIPs對印跡分子咖啡酸苯乙酯和結構類似物咖啡酸的選擇性，并通過吸附動力學和吸附等溫線對聚合物進行表征。將咖啡酸苯乙酯分子印跡聚合物作為固相萃取的吸附材料，從25種菇類中分離富集咖啡酸苯乙酯和咖啡酸。實驗結果表明，從7種菇類中檢測到咖啡酸的存在，含量在0.004～0.340 μg·g-1。此外，與商品化 C18 柱相對比，分子印跡柱對目標物表現出較好的親和性和選擇性，該方法應該能夠用于蜂膠中咖啡酸苯乙酯等類似物的檢測分析。

3.3 白楊素

白楊素又稱白楊黃素，在蜂膠中具有較高的含量，是合成抗癌、抗菌和消炎等藥物的原料之一。馬紅玲[30]以白楊素為印跡分子、丙烯酰胺為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、偶氮二異丁腈為交聯劑、環氧氯丙烷為親水調節劑、和DMF/甲醇為混合溶劑，采用沉淀聚合法制備了具有親水性能的開環MIPs，采用靜態吸附、動態吸附對MIPs的吸附性能進行了評價。結果表明開環MIPs微球對印跡分子呈現出了較好的結合能力，另外又測定了其親水性，實驗結果表明開環MIPs的親水性能得到了顯著提高。

4 MIT在蜂毒中的應用

4.1 蜂毒肽

蜂毒素（也稱為蜂毒溶血肽，即蜂毒肽，Melittin)占蜂毒干重的50%以上，由26個氨基酸組成，相對分子質量2984，不含二硫鍵，是蜂毒中的主要活性物質，具有抗菌、抗輻射和非常顯著的抗炎鎮痛作用，是迄今為止人類所知的抗炎活性最強的物質之一。Hoshino Y等[32]首先采用過水相沉淀聚合法制備蜂毒肽（26個氨基酸單元）印跡納米粒子。聚合單體包括作為骨架單體的N-異丙基丙烯酰胺和不同性質的其他功能單體，其中含有40%（wt）的疏水性N-叔丁基丙烯酰胺，這樣所得共聚物有較低的下限臨界溶解溫度，故室溫下就可通過自由基引發沉淀聚合。溶液中還加入了少量的十二烷基硫酸鈉以抑制生成納米粒子的聚集。納米蛋白質MIPs有望用于藥物設計和合成。許多疾病與酶的活性相關，很多基于小分子化合物的酶抑制劑已用于這些疾病的治療，但存在的普遍問題其對目標酶的選擇性低。其次Hoshino Y等[31]在動物體內的研究也取得了突破性的進展。他們制備了蜂毒素印跡納米粒，并首次作為解毒劑將其運用于小鼠體內，印跡納米粒經鼠尾靜脈注射后可與蜂毒素結合，在進入肝臟后被巨噬細胞攝取，起到解毒的功效。實驗表明，注射了印跡納米粒的小鼠存活率遠高于其對照組。研究結果表明，當分子印跡聚合物顆粒中包含適量的N-(1,1-二甲基乙基)-2-丙烯酰胺和丙烯酸時，聚合物表現出較強的結合蜂毒素的能力；當其Kd值是25 pmol·L-1時，非常接近蜂毒素自然抗體的Kd值17 pmol·L-1。該項研究首次實現了在體內環境中捕捉并中和蜂毒素，起到了和單克隆抗體相同的作用，這一方法的實現揭開了分子印跡技術在生物醫學領域的應用新篇章。并將其成功用于小鼠體內蜂毒素的捕獲和中和，起到了解毒效果，這將MIPs在體內的應用推向了新的范疇。Hoshino Y[33]還將蜂毒肽印跡納米粒子通過靜脈注射進白鼠體內，發現印跡粒子可結合血液中的蜂毒肽，從而可有效地緩解了白鼠的中毒癥狀。

4.2 蜂毒明肽

蜂毒明肽是蜂毒中的一種主要多肽，占蜂毒干量的3%，由18個氨基酸組成，分子量2035，是蜂毒中各組份中最小的神經毒肽，可透過血腦屏障。以藥物分子為模板，利用MIT合成的MIPs與藥物間的強相互作用可以延遲藥物的釋放，還可以通過光照、時間、特定分子的存在或者環境（pH、溫度等）改變來調控藥物的釋放速度。MIPs因制備簡單、能夠特異性結合/釋放藥物的特點在藥物遞送方面具有很大的應用潛力，可應用于靶向給藥系統等。表面分子印跡技術合成的MIPs進一步解決了MIPs中藥物包埋過深無法釋放、因位點不均導致藥量不可控等問題，并進一步提高了有效載藥量，使其在藥物遞送領域更具應用前景。Zhang Y等[34]用具有穩定兩親性分子結構的蜂毒明肽為支架、與膜蛋白p32結構類似的多肽為印跡分子、丙烯酰胺為單體，進行了構象表位印跡。因膜蛋白p32在各種腫瘤細胞的表達，所以該印跡模板可以作為靶向識別腫瘤細胞的靶點。聚丙烯酰胺作為光敏試劑的有效載體、聚合前加入甲基藍，則得到的MIPs在光照后可產生殺傷腫瘤細胞的活性氧，從而進行光動力治療。這種構象表位印跡策略構建一種新型光控腫瘤靶向藥物遞送系統。

5 MIT在蜂花粉中的應用

花粉是種子植物特有的結構，直徑大小不一，大都在4～200 μm。由于MIPs的孔穴能夠適用于不同大小（nm～μm）分析物/印跡分子的選擇性識別，所以MIPs能用于免疫球蛋白、胰島素和花粉等的檢測。Lieberzeit PA等[35]在人工材料內含有非共價相互作用的網絡這一重要技術能夠直接用來在線快速分析納米到微米級的生物分析物，如免疫球蛋白的小生物分析物作為IM在聚丙烯酰胺表面產生的識別位點能夠選擇性作用于10 nm大小的蛋白質分子，識別率高到足以區分人、牛和兔的免疫球蛋白。經過修飾的功能化表面材料可以相互作用于直徑約10 μm的花粉。樺樹花粉與其印跡位點相結合時容易產生Sauerbrey效應，由于聚合材料表面的自由流動性、非印跡材料太小的接觸面積導致正頻位移。25 Am的樺樹花粉在15 μm蕁麻花粉的印跡位點上也存在這種效應，因為分析物和聚合物印跡層的費共價鍵作用太小以至于不能緊密結合這些花粉分析物，所以也產生了正頻位移。最后，MIPs材料和相互作用生物分析物的反應孔穴大小可以調整到很高的值，以至于酵母可以作為模板分子固定到其表面。純水中受困細胞的滲透作用使得聚合物/生物復合材料上的這一結論顯示了大量的質量可逆增加。總體而言，該技術可以用于檢測酵母細胞的實時狀態。Latif U等[36]也認為MIT可以有助于合成如酵母、細菌細胞等較大顆粒的人工受體，以便來檢測酵母細胞的生長階段、區分細菌細胞株。甚至可以幫助人們合成MIPs識別材料以便分析植物花粉，MIPs敏感層的厚度決定了對印跡分析物的可逆包含作用。此外印跡分析物和孔穴間大小匹配和相互作用的測量描述決定著傳感器裝置的Sauerbrey和non-Sauerbrey作用。Latif U等[37]還探討了正、負f移位的產生機理，發現正f移位可以用一個其中振動傳感器表面耦合到固有的諧振頻率顆粒的耦合諧振模型來解釋。粒子的質量和接觸點粘度/粘結強度決定了它的固有共振頻率。強相互作用會使粒子和振動面依次串列在一起，即似Sauerbrey行為；而弱相互作用可以使粒子在表面上自由振動，從而產生正f的變化。在具有弱相互作用的氣相和液相中可以觀察到正f位移。當芝麻抗體和芝麻蛋白作用時發生負f位移，而和杏仁蛋白作用時能發生正f位移。因此認為正、負f移位甚至可以被用來辨別分析物的選擇性的和非選擇性的相互作用。從而研制出一種能夠分化腫瘤細胞和細胞器的多孔聚合物材料、并設計出了能夠選擇性識別μm級大小花粉粒的結構化聚合物。

6 MIT在蜂王漿中的應用

Sakamoto Y等[38]以氯霉素為印跡分子，制備了作為固相萃取劑的MIPs，經LC-UV、LC-MS和ELISA方法對清除效率的評估發現其對氯霉素的吸附效果高于傳統的反相固相萃取劑，蜂王漿中氯霉素的回收率分別為75%，MIPs萃取劑的使用消除了傳統固相萃取劑萃取后存在的干擾峰，采用MIPs能夠萃取、清除蜂王漿中的雜質，該方法有望用于檢測蜂產品、畜牧產品中的氯霉素殘留。

蜂王酸，學名10-羥基-2-癸烯酸(10-Hydroxy-2-decenoic acid,10-HDA)，是蜂王漿中一種重要的不飽和脂肪酸，具有增強機體免疫力、抗菌、抗癌、抗腫瘤、治療化學物質所致損傷等多種生理功能。衛莎[39]采用MIT中本體聚合的方法，以蜂王酸為印跡分子，4-乙烯基吡啶為功能單體，N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺為交聯劑，制備了能夠特異性識別蜂王酸的分子印跡聚合物。經過一系列的優化，確定了蜂王酸MIPs的最佳制備條件，并且對聚合物進行了吸附性能表征、紅外光譜表征和掃描電鏡表征。結果表明，所制備的聚合物具有較快的吸附速率和較高的吸附容量，并通過Scatchard方程對材料結合性能進行分析，計算印跡聚合物的飽和吸附容量Qmax可達858.4 mg·g-1。將制備的蜂王酸分子印跡聚合物作為固相萃取的填充材料，建立固相萃取與高效液相色譜儀聯用的方法，檢測蜂王漿及其制品中蜂王酸的含量。對固相萃取條件如上樣溶液pH、上樣速度、淋洗液、洗脫液及其用量進行了優化。所建立方法的檢出限(S/N=3)為 0.94 μg·L-1，線性范圍為 10 μg·L-1～1000 μg·L-1(R2＞0.99)，九次平行實驗的相對標準偏差小于4.54%。選擇蜂王漿、蜂王漿凍干粉和蜂王漿口服液進行添加回收實驗，蜂王酸的回收率均在86.53～103.28%之間，實驗證明了所建方法的準確性和實用性。

7 結論與展望

近年來快速發展的MIT在蜂產品中污染物殘留分析方面的應用得到了很多科學家和科研機構的極大重視，尤其是抑菌劑、農藥等污染物殘留的分析檢測和蜂產品中有效物質的富集、分離和檢測，但是還存在一些亟待解決的問題。MIPs的制備技術仍需進一步改進，以提高MIPs的選擇性識別能力、對印跡分子的結合量和結合位點的均一性；天然的識別系統大都在水溶液中進行，而現階段的大多數MIPs只能在有機相中聚合、應用，在水等極性溶劑中制備和應用MIPs的問題還尚未完全解決；當前的印跡分子還是以小分子化合物為主，類似蛋白質、花粉和DNA/RNA等生物大分子化合物的印跡仍有待研發；納米蛋白質MIPs的體內應用還面臨很多重要問題，如生物相容性和細胞穿透性等問題；雖然MIT的靈敏度有所提高，但是距離蜂產品實樣中農藥等污染物殘留的快速分析還有許多工作要做；MIPs的商品化應用還處于摸索階段。盡管MIT在蜂產品中農藥等污染物殘留分析方面還有許多問題尚未完全解決，但是隨著制備方法的改善、實驗條件的優化、新分析方法的介入和理論知識的不斷發展，MIT在人工抗體等方面將有更加廣闊的應用前景和發展潛力。

[1]周杰,何錫文.分子模板聚合物在分析化學中的應用 [J].分析測試學報,1998,5:89-93.

[2]陳長寶,周杰,吳春輝.分子印跡技術研究進展[J].化學研究與應用,2006,8:896-902.

[3]曲祥金,周杰.分子印跡聚合物的制備技術研究進展 [J].山東農業大學學報(自然科學版),2000,4:457-462.

[4]司汴京,陳長寶,周杰.新一代分子印跡技術 [J].化學進展,2009,9:1813-1819.

[5]李潔,陳長寶,張麗麗,等.孔雀石綠分子印跡表面等離子共振傳感器的制備及分析應用[J].分析科學學報,2014,6:873-878.

[6]Zhu CC,Zhang LL,Chen CB,et al.Determination of Bisphenol A using a Molecularly Imprinted Polymer Surface Plasmon Resonance Sensor[J].Analytical Letters,2015,48(10):1537-1550.

[7]陳黎紅,張復興.新形勢下蜂業發展新思路-農業部《全國養蜂業“十二五”發展規劃》解讀[J].農業展望,2011,5:39-48.

[8]余林生,吉挺,張中印,等.生態環境對蜜蜂與蜂產品安全生產的影響[J].中國蜂業,2009,60(10):45-47.

[9]涂熹娟,高照生,馬雙琴,等.分子印跡固相萃取在蜂蜜污染物殘留分析中的研究進展[J].蜜蜂雜志,2016,36(9):1-4.

[10]周金慧,李熠,吳黎明,等.2012年國內外蜂產品質量安全研究進展[J].中國蜂業,2013,64(Z1):67-74.

[11]周金慧,郭偉華,李熠,等.2013年國內外蜂產品質量安全研究進展[J].中國蜂業,2014,65(3):40-42.

[12]張文文,周金慧,郭偉華,等.2014年國內外蜂產品質量安全研究進展[J].中國蜂業,2015,66(6):19-24.

[13]Bougrini M,Florea A,Cristea C,et al.Development of a novel sensitive molecularly imprinted polymer sensor based on electropolymerization of a microporous-metal-organic framework for tetracycline detection in honey[J].Food Control,2016,59:424-429.

[14]Moreno-González D,Lara FJ,Jurgovská N,et al.Determination of aminoglycosides in honey by capillary electrophoresis tandem mass spectrometry and extraction with molecularly imprinted polymers[J].Analytica Chimica Acta,2015,891:321-328.

[15]Mitrowska K,Posyniak A,Zmudzki J.Selective Determination of Fourteen Nitroimidazoles in Honey by High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry [J].Analytical Letters,2014,47(10):1634-1649.

[16]Chen LG,Li B.Magnetic molecularly imprinted polymer extraction ofchloramphenicol from honey[J].Food Chemistry,2013,141(1):23-28.

[17]Song B,Zhou YS,Jin H,et al.Selective and sensitive determination of erythromycin in honey and dairy products by molecularly imprinted polymers based electrochemical sensor [J].Microchemical Journal,2014,116:183-190.

[18]Lv YK,Jia CL,Zhang JQ,et al.Preparation and characterization of molecularly imprinted monolithic column for on-line solid-phase extraction coupled with hplc for determination of the fluoroquinolone residues in honey samples[J].Journal of Liquid Chromatography&Related Technologies,2013,36(2):249-260.

[19]夏環,王妍,荊濤,等.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中三種氟喹諾酮類抗生素殘留[J].分析科學學報,2012,28(3):297-302.

[20]Chen LG,ZhangXP,Sun L,et al.Fast and Selective Extraction of Sulfonamides from Honey Based on Magnetic Molecularly Imprinted Polymer[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(21):10073-10080.

[21]He J,Song LX,Chen S,et al.Novel restricted access materials combined to molecularly imprinted polymers for selective solid-phase extraction oforganophosphorus pesticides from honey[J].Food Chemistry,2015,187:331-337.

[22]高林.熒光單體構筑的分子印跡傳感器選擇性識別環境內分泌干擾物殘留的行為和機理研究[D].江蘇:江蘇大學,2016.

[23]鄭紅,張迎雪.毒死蜱分子印跡聚合物的制備與性能研究[J].重慶師范大學學報自然科學版,2011,28(5):73-76.

[24]Zhou TY,Hou J,Yuan D,et al.Determination of triazine herbicides from honey samples based on hydrophilic molecularly imprinted resins followed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].RSCAdvances,2016,6(101):98663-98673.

[25]Herrero-Hernández E, Carabias-Martínez R, Rodríguez-Gonzalo E.Use of a bisphenol-A imprinted polymer as a selective sorbent for the determination of phenols and phenoxyacids in honey by liquid chromatography with diode array and tandem mass spectrometric detection[J].Analytica Chimica Acta,2009,650(2):195-201.

[26]Cizmárik A,Hrobonová K,Lehotay J,et al.Examination of the chemical composition of propolis VII:Use of molecularly imprinted polymers for SPE of umbelliferone from propolis [J].Farmaceuticky Obzor,2011,80(10):251-256.

[27]Hroboňová K,LehotayJ,Cizmarik J.Examination ofthe chemical composition of propolis IX.Solid phase ectration of coumarins from propolis by using molecularly imprinted polymer [J].Nova Biotechnologica Et Chimica,2013,12(1):1-11.

[28]Hrobonová K,Spevak A,Spisská L,et al.Application of umbelliferone molecularly imprinted polymer in analysis of plant samples[J].Chemical Papers,2013,67(5):477-483.

[29]李寧.用分子印跡技術分離純化菇類抗氧化成分以及該成分在氧化應激中的保護機制[D].天津:南開大學,2013.

[30]馬紅玲.沉淀聚合法制備分子印跡聚合物及其性能研究[D].黑龍江:齊齊哈爾大學,2009.

[31]HoshinoY,Kodama T,Okahata Y,et al.Peptide imprinted polymer nanoparticles:A plastic antibody [J].Journal of the American Chemical Society,2008,130(46):15242～15243.

[32]Hoshino Y,Koide H,Urakami T,et al.Recognition,neutralization,and clearance of target peptides in the bloodstream of living mice by molecularly imprinted polymer nanoparticles:A plastic antibody[J].Journalof the American ChemicalSociety,2010,132(19):6644-6645.

[33]Hoshino Y.Affinity purification of multifunctional polymer nanoparticles[J].Journal ofthe American Chemical Society,2010,132(39):13648～13650.

[34]Zhang Y,Deng CY,Liu S,et al..Active Targeting of Tumors through Conformational Epitope Imprinting [J].Angewandte Chemie International Edition,2015,54(17):5157-5160.

[35]Lieberzeit PA,Chen X,Seidler K,et al.Functional Materials for Biosensing-FromProteins toCells and Pollen[J].Sensor Letters,2008,6(4):641-645.

[36]Latif U,Dickert FL.Biomimetic Materials for Enrichment of Bioanalytes-Sensor Applications[J].Journal of Biolgical Research,2012,1(3):63-68.

[37]Latif U,Can S,Hayden O,et al.Sauerbrey and anti-Sauerbrey behavioral studies in QCMsensors-Detection ofbioanalytes[J].Sensors and Actuators B:Chemical,2013,176:825-830.

[38]Sakamoto Y,Saito K,Hata R,et al.Determination of Chloramphenicol in Honey and Royal Jelly by Sample Clean-up with Molecular Imprinted Polymer[J].Bunseki Kagaku,2012,61(5):383-389.

[39]衛莎.蜂王酸分子印跡聚合物的制備及應用 [D].天津:天津科技大學,2014.