分子印跡技術在蜂產品中的研究進展

陳長寶 劉新迎 汪建民 牛華星 王士強 秦浩然 尹旭升

（1山東農業大學化學與材料科學學院，泰安271018；2山東省蜂業良種繁殖推廣中心，泰安271000；3山東省獸藥質量檢驗所）

分子印跡技術在蜂產品中的研究進展

陳長寶1劉新迎2汪建民1牛華星3王士強2秦浩然2尹旭升2

（1山東農業大學化學與材料科學學院，泰安271018；2山東省蜂業良種繁殖推廣中心，泰安271000；3山東省獸藥質量檢驗所）

具有專一性和選擇性的分子印跡技術已經廣泛用于蜂產品的安全檢測和有效成分的提取中，并且很好地解決了復雜基質蜂產品中農藥等污染物殘留分析前處理用時長和技術難度大等問題。本文綜述了分子印跡技術在蜂蜜、蜂膠和蜂花粉等蜂產品中的應用，并總結了存在的問題、展望了應用前景。

分子印跡技術;分子印跡聚合物;印跡分子;蜂產品;農藥

2 MIT在蜂蜜中的應用

2.1 抑菌劑

四環素是一種廣譜抑菌劑，對蜂蜜中革蘭氏陽性菌和陰性菌等有良好的抑制作用。Bougrini M等[13]改善了MIPs的制備方法，印跡分子四環素存在時用修飾了p-氨基巰基酚的金納米顆粒作為載體在金電極表面制備了具有微孔-金屬-有機架構的MIPs傳感器，以亞鐵氰化物或鐵氰化物作為氧化還原探針采用線性掃描伏安法表征了MIPs電化學傳感器，經過實驗條件的優化，此MIPs傳感器分析獸藥四環素的線性范圍和檢測限分別達到224～22.4 nmol/L、0.22 fmol/L，并成功應用于蜂蜜中四環素的分析。氨基糖苷類抗生素是一類苷類抑菌抗生素，主要用于蜂蜜靜止期殺菌。

Moreno-González D等[14]在樣品前處理中選用了具有高選擇性的MIPs作為萃取材料來提取蜂蜜中九種氨基糖苷類抗生素，用毛細管區帶電泳串聯質譜對其進行了鑒定和分析。在優化的條件下，檢測方法的準確度和精密度分別為88.2～99.8%、≤8%，線性范圍和檢出限分別為 3.5～60.5 μg/kg、6.0～103.1 μg/kg。硝基咪唑類是一類合成抑菌類藥物，對蜂蜜中各種厭氧菌具有強大的抑制作用。Mitrowska K等[15]首先利用改進的MIPs從蜂蜜中固相萃取出硝基咪唑類藥物及部分相應的羥基代謝產物等十四種化合物，其次利用HPLC-MS對其進行了檢測。色譜分離條件是采用C18反相柱、0.1%甲酸的乙腈溶液和0.1%甲酸的水溶液組成的梯度洗脫流動相。優化后的色譜條件適用于甲硝唑和羥基化甲硝唑等十四種硝基咪唑類藥物。并且根據歐盟委員會決議2002/657/EC的要求，對分析方法的線性、特異性、回收率和再現性等技術指標進行了評估，這種檢測方法可以用于各種蜂蜜樣品的分析。氯霉素屬于抑菌性廣譜抗生素，是治療蜂蜜中厭氧菌感染的特效藥物之一。Chen LG等[16]以氯霉素為印跡分子，制備了適用于萃取蜂蜜中氯霉素的磁性MIPs。將蜂蜜樣品、萃取劑和磁性MIPs攪拌均勻萃取完全后，采用外部磁力樣品基質中分離出吸附了氯霉素的磁性MIPs，用LCMS分析經由甲醇超聲洗脫出的待分析物。在優化條件下，氯霉素的檢測限高達0.047 ng/g，日內、日間的RSD范圍分別是4.1～5.3%、2.9～7.1%。將該檢測方法用于六種蜂蜜樣品的檢測分析，回收率為84.3～90.9%。紅霉素是用于防治蜂蜜中鏈球菌的大環內酯類抗生素。Song B等[17]采用選擇性和靈敏度較高的MIPs-ECS聯用技術測定了蜂蜜中的紅霉素，MIPs作為選擇性識別元件提高了電化學傳感器的選擇性和靈敏度。用制備的MIPs修飾碳糊電極，MIPs對印跡分子紅霉素具有很好的吸附能力，最大結合量為93.5 mg/g，印跡因子為2.1。MIPs碳糊電極和微分脈沖伏安法聯用可以定量分析紅霉素，與非MIPs碳糊電極相比，MIPs碳糊電極對紅霉素的識別能夠產生更好的電流響應，并且對紅霉素結構類似物具有很高的辨別力。在優化條件下，該方法的線性范圍和檢測限分別為 5×10-8～1.0×10-5mol/ml、1.9×10-8mol/ml。這種選擇性好、靈敏度高的傳感器已經成功應用于蜂蜜、奶制品中紅霉素的檢測，在檢測大宗食品中紅霉素殘留方面也具有很大的應用潛力。喹諾酮類是一類適于防治敏感菌的抗菌藥。Lv YK等[18]以氧氟沙星為印跡分子、甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、氯仿和月桂醇作為致孔劑在不銹鋼色譜柱中原位制備了MIPs整體柱，該色譜柱作為在線固相萃取柱與HPLC聯用，可以用來分析蜂蜜中的喹諾酮類藥物的殘留。在最佳合成條件和在線固相萃取條件下，采用斯卡查德分析和突破曲線分析該分子印跡整體柱得出其對喹諾酮類殘留藥物最大的結合能力和動態結合能力分別為 51.50 mg/g、434.92 μg/ml，高于非MIPs整體柱的相應結合能力43.15 mg/g和96.52 μg/ml。夏環等[19]以諾氟沙星為印跡分子沉淀聚合了對氟喹諾酮類抗生素具有特異性識別的MIPs，其印跡因子和親和位點總數分別為 3.17 μmol/g、3.27 μmol/g。用該MIPs作為固相萃取填料建立了檢測蜂蜜中三種氟喹諾酮類抗生素殘留的MIT-SPE-HPLC法MIPs萃取柱與Oasis HLB商品柱的相比較發現，該MIPs-SPE具有更好的凈化能力和富集效率。磺胺類藥物是一種蜂蜜中常用的抑菌劑，Chen LG等[20]首次報道了磁性MIPs用于蜂蜜中殘留磺胺類藥物的磁性d-SPE研究，文章采用共沉淀聚合法制備了磁性MIPs，借助外磁場的快速分離，僅需15min就可以完成單次萃取過程。

2.2 農藥

有機磷農藥是用于防治植物病、蟲、害的一類有機磷化合物，因為蜜蜂采集時的復雜性，蜂產品中不可避免地會有所殘留。為了分析蜂蜜中殘留的有機磷農藥，He J等[21]將新型材料（Restricted Access Materials,RAM）與MIT相結合，以馬拉松硫磷為印跡分子、縮水甘油基甲基丙烯酸酯為親水性共聚單體，合成了用于檢測蜂蜜中的六種有機磷農藥（馬拉硫磷、滅線磷、甲拌磷、特丁硫磷、樂果和苯線磷）。采用的新型材料RAM可以有效阻止蜂蜜含有的大分子進入萃取材料而降低了基質的干擾。在優化的萃取條件下，同商品化的C18和Florisil固相萃取柱相比，RAM-MIPs對六種目標有機磷農藥的萃取效果相當，甚至在萃取容量上稍勝一籌。RAM-MIPs-GC法成功地應用于上述六種有機磷農藥的同時檢測，并具有良好的線性關系（0.01～1.0 μg/ml）和較低檢出限（0.0005～0.0019μg/ml），分析結果的準確度和精密度分別為90.9～97.6%、RSD 2.26～4.81%（n=6）。三氟氯氰菊酯是一種高效農藥菊酯類殺蟲劑，會通過各種方式殘留在蜂產品中。高林[22]將熒光識別技術和MIT聯合建立一種集選擇性識別、分析一體化的熒光傳感技術，即利用窄發射譜、高量子效率的熒光染料為熒光團，選擇性識別材料為給體，分別以有機聚合質材料選擇性識別菊酯類殺蟲劑和酚類內分泌干擾物中的代表性化合物三氟氯氰菊酯、2,4,6-三氯酚殘留，構建具有熒光可控、穩定性好、特定活性位點多、快速、選擇性識別型MIPs熒光傳感器并應用于蜂蜜等試劑樣品中污染物殘留的選擇性熒光識別與檢測。毒死蜱是一種屬于硫代磷酸酯類的高效、廣譜有機磷殺蟲劑，是乙酰膽堿酯酶的抑制劑。鄭紅[23]以毒死蜱為印跡分子,采用原位逐步聚合法制備了具有良好識別性能,考察了毒死蜱、敵敵畏及甲胺磷在毒死蜱分子聚合物上的選擇性分離富集特性。用毒死蜱分子聚合物固相萃取了蜂蜜等實際樣品中的毒死蜱，結果表明，聚合物對印跡分子產生了印跡識別效應，對毒死蜱有明顯的選擇識別性，流速為1.0 ml/min，進樣量為20 μl，加樣回收率為96～102%，RSD小于6.6%。

2.3 除草劑和雙酚A

三嗪類除草劑通過光合系統Ⅱ（PSⅡ）以D1蛋白為作用靶標抑制植物的光合作用，會通過各種渠道進入蜂產品中。Zhou TY等[24]以莠滅凈為印跡分子、間苯二酚和三聚氰胺為雙功能單體、甲醛為交聯劑制備了分子印跡樹脂。含有大量親水性官能團的分子印跡樹脂具有良好的水分散性和均一的球狀形態。MIPs樹脂作為固相萃取材料能夠快速、簡單、高效地從蜂蜜樣品中成功萃取-凈化得到六種三嗪類除草劑，結合HPLCMS分析法，在優化的最佳實驗條件下，六種三嗪類除草劑的檢出限范圍是0.02～0.125 ng/g，添加濃度為5ng/g標準品時的回收率范圍為(83±4)～(97±4)%。該方法操作簡單、分析速度快，既能從蜂蜜樣品和水樣品中高效萃取到殘留的三嗪類除草劑，也能對其進行分離、分析。苯氧酸類除草劑是一類消滅或抑制植物生長的化合物；雙酚A是重要的有機化工原料，會通過各種塑料材料使用而殘留到蜂產品中。Herrero-Hernández E等[25]以雙酚A作為印跡分子，采用沉淀聚合法制備了用于提取蜂蜜中酚類化合物（雙酚A、雙酚F和4-硝基酚）和苯氧酸類除草劑（2,4-D、2,4,5-T和2,4,5-TP）的MIPs萃取劑。與商品化OasisHLB固相萃取柱的凈化效果相比較發現，合成的MIPs固相萃取柱具有優異的選擇性，結合HPLC-DAD-MS檢測到洗脫物中只含有類似目標結構化合物，回收率達到81～96%，檢測限為0.1～3.88 ng/g，有效降低了蜂蜜中干擾組分的影響。

3 MIT在蜂膠中的應用

3.1 傘形花內酯

傘形花內酯是一種蜂膠內含有的香豆素類化合物，有抗菌、降壓、抗癌作用。Cizmárik A等[26]以傘形花內酯為印跡分子、甲基丙烯酸為單體、乙醇/乙腈作為致孔劑采用多種方法制備了MIPs，并檢測了其比容量的效率。實驗發現，乙腈為致孔劑、甲醇/水體積比為1∶1時制備MIPs的比容量達到最佳。用MIPs可以萃取蜂膠酊中的傘形花內酯，實驗結果表明，制備的傘形花內酯MIPs對印跡分子具有結構選擇性和非特異性相互作用。Hroboňová K等[27,28]用傘形花內酯作為印跡分子、甲基丙烯酸為功能單體、乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑、氯仿為致孔劑本體聚合了對傘形花內酯和4-甲基傘形酮等四種香豆素類化合物具有選擇性識別的MIPs，采用靜態吸附法、HPLC和前沿分析法對MIPs進行了評價，發現其具有良好的選擇性和對傘形花內酯2.69 μg/g的結合吸附容量。通過探討樣品溶劑的影響得到了MIPs的最大吸附容量。MIPs用作固相萃取劑從蜂膠中萃取出香豆素類化合物，然后再進行HPLC分析。該方法的回收率均在70%以上，分析化合物的定量限為0.3～10 ng/mL(采用熒光檢測確定)，是一個增強樣品凈化程度和提高蜂膠樣品中傘形花內酯回收率的離線固相萃取法。

（未完待續）

The research progress of molecular imprinting technique in bee products

Chen Changbao1,Liu Xinying2,Wang Jianmin1,Niu Huaxing3,Wang Shiqiang2,Qin Haoran2,Yin Xusheng2
(1 College of Chemistry and Material Science,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China;2 Seed-breeding Bee Industry Promotiong Center in ShanDong Province,Tai’an 271000,China;3 Shandong Provincial Verterinary Medicine,Jinan 250022,China)

Molecular imprinting technique owned the specific selectivity has been widely used in safety testing and extraction of effective components in bee products,and excellently solved time-consuming and needed difficult technique in the pretreatment and analysis of pesticides etc residue for the complex matrix-bee products.This paper reviews that the molecular imprinting technique was used to apply in honey,propolis,and pollen etc bee products.Finally the existing problems in the field were summed up and the application prospect was forecasted.

Molecular Imprinting Technique;Molecularly Imprinted Polymers;Imprinted Molecule;Bee Products;Pesticides

1 引言

國家自然科學基金（21175083,31370686），山東省自然科學基金(ZR2013CQ014)，現代農業產業技術體系（SDAIT-24-05)，農產品質量安全監管專項(18162130109236）

陳長寶(1978-)，男，實驗師，研究方向:生物化學分析，E-mail:chchbao@sdau.edu.cn。

尹旭升(1972-),男，研究員，研究方向:蜂產品加工與推廣，E-mail:xushengyin@163.com。留物，能較好地解決從蜂產品等復雜基質中檢測痕量藥物殘留的前處理問題。涂熹娟曾詳實地綜述了分子印跡固相萃取技術在蜂蜜中污染物殘留分析的研究進展，但是未涉及到蜂膠、蜂毒和蜂花粉等蜂產品中的MIT應用[9]。趙靜課題組自2011年來連續五年就國內外蜂產品質量安全研究進展展開論述，因篇幅有限，僅涉及了部分MIT在蜂產品中的研究[10-12]。本文將主要論述MIT在蜂蜜、蜂膠、蜂毒和蜂花粉等蜂產品中的應用和研究前景，以供業內同行參考，使MIT在蜂產品中具有更廣、更深的應用。

分子印跡技術 (Molecular Imprinting Technology,MIT)[1,2]是指在空間立體結構和結合位點上制備對某一特定的目標分子[印跡分子(Imprinted Molecule,IM)]具有特異選擇性聚合物的制備技術。這種制備技術是仿照抗原-抗體的作用機理，圍繞著印跡分子形成一個高度交聯的剛性高分子聚合物 (Molecularly Imprinted Polymers,MIPs)，去除印跡分子后就在MIPs的網絡結構中留下與IM在空間結構、尺寸大小、結合位點互補的立體孔穴，從而對IM表現出高度的專一性、識別性和選擇性能。因為MIPs具有預定性（依據不同目的制備相應的MIPs）、對印跡分子專一的識別性、高度的穩定性、較長的使用壽命和簡單易行的制備過程等優點。

近二十年來，分子印跡領域的研究非常活躍，在MIPs的制備、表征、分析和測試方面積累了非常豐富的經驗[3-6]。近年來，食品安全已經成為全球重要的公共安全問題之一，蜂產品的質量安全更是蜂產業能夠持續健康發展的關鍵所在[7]。蜂產品的品質與其生產過程中所在的環境息息相關，自然環境中的化學物質和蜂群養殖過程中使用的藥物在蜂產品中的殘留也一直是蜂產業質量安全的關注焦點[8]。農藥等污染物的殘留不僅會通過致癌、致畸和致突變而危害人體健康，甚至會因為各國對藥物殘留檢測靈敏度的不同而影響蜂產品在國際間的正常貿易。采用MIT提取、凈化和富集藥物殘