甲基化在肺癌研究領域的相關進展

張少偉 薛志強

包括肺癌在內的絕大部分疾病的發生、發展甚至預后、轉歸都與遺傳因素息息相關,然而經典的遺傳學說--DNA決定一切,或者說基因決定表型--并不能圓滿地解釋人類對于疾病在這些方面的困惑.隨著人類基因組計劃的完成,令人困惑的諸多問題并沒有如事先預料的那樣得到完美的解答[1,2],遑論解決臨床棘手問題了.挑戰隨之而來,表觀遺傳學說不依賴DNA序列改變而又可遺傳的基因表達改變[3,4],因此得到研究人員的重視并有了更大的發展.事實上,早在1942年Waddington就提出了Epigenetics一詞并給出了其含義[5,6],然而由于技術及后續遺傳領域專注于DNA方面的經典遺傳學研究等原因,表觀遺傳的研究并沒有很大的發展.2003年人類表觀基因組計劃(Human Epigenome Project, HEP)開始實施[6,7].其中DNA甲基化與組蛋白的甲基化修飾是其兩項重要內容.尤其DNA甲基化作為表觀遺傳學研究的熱門領域,隨著甲基化特異性PCR(methylation-specif i c PCR, MS-PCR)技術的開發,其發展得到極大助力,在肺癌相關領域,涉及到基于特定基因DNA甲基化的早期診斷、分期分級診斷、化療藥物的個體化篩選、預后判斷的研究日益增多;針對甲基化轉移酶的藥物已開始進行臨床試驗并取得了良好療效.組蛋白修飾是表觀遺傳學的另一重要內容,其中的甲基化修飾近年來也取得了重要進展[8,9].

1 DNA甲基化

DNA甲基化是指甲基供體(S-腺苷甲硫氨酸,SAM)在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMT)的作用下,將甲基添加到DNA分子的堿基上,以胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸(CpG)中的胞嘧啶5位碳原子和甲基間的共價結合最常見[10,11],CpG中胞嘧啶由此被修飾為5甲基胞嘧啶(5mC).DNA甲基化修飾后在離體狀態表現出更強的惰性,如亞硫酸氫鈉可使非甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶,而不能改變甲基化的CpG中的胞嘧啶;在活體狀態表現為基因表達活性的降低.因此,高甲基化狀態意味著基因表達的失活/抑制/沉默[12],而低甲基化狀態意味著基因表達的激活/活化.早期的研究發現,腫瘤細胞的DNA甲基化狀態在全基因組水平上是廣泛的低甲基化,導致原癌基因的活化,基因組不穩定性增加.后期研究發現,腫瘤細胞在抑癌基因、修復基因等啟動子區的甲基化狀態是升高的,即高甲基化,從而導致了相應抑癌基因等的表達受到抑制[13,14].且發現腫瘤細胞的高甲基化基因多發生于啟動子區的CpG島,而正常細胞啟動子區的CpG島多處于非甲基化狀態.

在包括肺癌在內的絕大多數腫瘤以及諸如阿爾茲海默病、心衰等非腫瘤性疾病的患者的基因組水平均發現了DNA甲基化的異常[15].由于人類基因組包含近四萬個基因,大量研究發現許多疾病均可能存在特異性的甲基化譜,甚至在疾病的不同階段甲基化譜也不盡相同;此外,據研究腫瘤細胞發生CpG島高甲基化的頻率遠高于基因突變[16].因此,通過對患者樣本進行特定一組基因或全基因組的甲基化水平檢測,理論上可以診斷疾病、輔助進行分級分期的判斷甚至篩選敏感化療藥物.

1.1 DNA甲基化與肺癌診斷(早期診斷、分型、分級分期)早在2005年,德國海涅大學的Schmiemann V等在發現肺癌患者中存在APC、p16(INK4a)、RASSF1A等基因的甲基化狀態異常后,就提出了利用通過甲基化檢測來進行肺癌的早期診斷[17].

之后,借助于以MS-PCR為代表的檢測技術發展,類似的研究迅猛增加,同時發現了更多的具有相對特異性的基因,如P16、RASSF1A、APC、MGMT等[18,19].一項基于痰液樣本的RASSF1A、PRDM14和3OST2聯合檢測研究,用于區分無瘤吸煙者和I期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),結果顯示敏感性達82.9%,特異性達76.4%[20].Kikuchi等研究發現,DAL-1基因的甲基化隨著肺癌分期的進展而出現變化[21].隨著研究的深入,發現基因組的低甲基化隨著細胞惡性度的增加而愈加明顯,有作為病情變化的判斷指標的潛力[22].有meta分析表明常見于NSCLC的WIF-1基因高甲基化不僅更傾向發生于鱗癌,而且其表達與較差的臨床預后同樣相關[23].在小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的研究上,Saito Y等通過對28例手術的SCLC患者病理組織進行檢測分析,發現CpG島甲基化表型(CpG island methylator phenotype, CIMP)是切除后SCLC的不良預后的預測因子[24].這些研究表明,通過對特定基因的DNA甲基化的結果進行分析,有望為臨床醫生提供早期診斷、病情分期等有益的信息.不僅如此,基于hOGG1基因啟動子甲基化在NSCLC中頻繁發生的情況,有研究人員通過檢測外周血單核細胞的hOGG1基因甲基化水平,發現甲基化的hOGG1基因攜帶者發展為NSCLC的幾率是非甲基化hOGG1基因攜帶者的2.25倍,作者認為此研究可以在將來為特定人群提供肺癌發病風險預測有較大益處[25].

但是,另一方面,對于同一種基因的甲基化狀態在同一種疾病或者細胞系的檢測結果,不同研究人員提供的數據差異很大[26].例如,NSCLC中ATM甲基化陽性率在三個研究中的分別是47%(49/105)、0(0/37)、19%(34/180)[26-29];因預測神經膠質瘤患者對烷化劑敏感性而成為明星基因的MGMT,針對其在NSCLC患者的甲基化狀態進行的4項研究[30-33]中,陽性率分別為50.4%(111/220)、30.3%(37/122)、17%(12/72)、16.6%(33/199).關于檢測結果變異較大的原因,Hongdo等[26]認為需要強調甲基化檢測技術重要性以保證檢測結果的可重復性及信度,同時提及種族差異的潛在影響.但是,作者認為MS-PCR等技術的改進使得檢測的靈敏度及特異度大大提升的同時,也降低了檢測結果的假陽/陰性率,最終使得結果可重復性與信度得到提高.2015年,霍普金斯大學一個研究團隊就開發了一種新技術--DREAMing[34],該技術可以定量分析存在于NSCLC患者諸如血漿等液基標本中的極微量(0.005%的單拷貝水平)的異質性表觀等位基因,這也為更為深入的科學研究及臨床應用打下了良好的基礎.

總之,DNA甲基化檢測為解決這些棘手的臨床問題提供了新的思路與方向,但針對特定基因的測定、具體基因與疾病相關性的分析及其意義的確定,可能還有相當長的路要走.檢測技術的不斷發展,測定標準的嚴格控制或許會加快DNA甲基化檢測技術實際應用于臨床的步伐.

1.2 DNA甲基化與肺癌治療方案的選擇 眾所周知,傳統的肺癌化療或輔助化療方案的制定多是基于患者腫瘤的病理分型及化療方案實施后患者和腫瘤反應情況來確定,但是同一病理類型的患者接受同一種化療方案獲得的實際療效差異卻很大,而且在一部分患者身上可能僅僅表現出了化療的副作用.因此,針對具體病患的個體化醫療得到越來越多患者及醫療人員的支持.隨著表觀遺傳相關研究的深入,人員發現了某些基因與特定藥物治療反應的敏感性.例如有研究發現MGMT甲基化導致的基因表達失活發生在很多神經膠質瘤患者瘤內,它的發生與患者對烷化劑的敏感程度密切相關,并能提高患者的總體生存率及疾病進展時間[18,35].

這個發現引起了科研人員的極大興趣,在肺癌的相關領域,Hsu等[36]發現術后NSCLC患者的CpG島甲基化是導致的抑癌基因p14ARF的表達失活和p53過表達降低的原因.后續研究中發現RASSF1A甲基化可作為評估NSCLC患者使用吉西他濱(gemcitabine)取得較好療效一個獨立預后因子[37];而在針對靶向藥物吉非替尼(geftinib)耐藥機制的研究中,發現可能會使p14ARF表達增加的肺腺癌患者受益[34,38].相信這些研究結果會使更多的患者因更為精準的治療而受益.在一個基于mRNA、microRNA和DNA甲基化標記物聯合應用分析I期肺腺癌預后的隊列研究中,發現HOXA9啟動子區的高甲基化意味著更糟糕的總體生存率和更高的腫瘤復發率;三種標記物的聯合應用可以更為明確地將兩個隊列中的高復發危險的患者識別出來[39].作者認為如果這個研究能進一步得到驗證,那無疑是對肺癌傳統TNM分期的挑戰,未來TNM分期可能需要把患者的表觀遺傳變異指標納入考慮范圍.

1.3 DNA去甲基化藥物與肺癌治療 如前所述,傳統針對肺癌的化療效果并不令人滿意,即使有了更為先進的辦法去預測患者對于某種具體藥物是否敏感或耐藥,也并不能在很大程度上提高患者的長期生存率,況且到目前為止也只能給部分具有特定表觀遺傳改變的某些腫瘤亞組的患者指導治療,尤其是當檢測結果提示是耐藥時,可能會給患者帶來更多的擔憂而非希望.然而,與經典遺傳學研究的DNA序列改變具有的不可逆性不同的是,包括DNA甲基化及組蛋白甲基化修飾在內的多數表觀遺傳學改變是可逆的[40],通過逆轉DNA甲基化治療疾病的思路為疾病治療描繪了樂觀的藍圖.

DNA甲基化的形成與維持均在DNMT作用下實現的.DNMT共3個家族,即Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3,其中Dnmt3包括Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L.人類體內有Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b[41].其中Dnmt1在DNA半保留復制時催化并維持新生鏈的DNA甲基化狀態;而Dnmt3a與Dnmt3b在胚胎發育期間發揮主要作用,催化從頭甲基化.三種DNMT共同維持DNA甲基化狀態,并表現為正常組織低表達與腫瘤組織中的高表達[42].以DNMT為作用靶點成為藥物研發的新方向.有研究發現,HOXA1甲基化在SCLC耐藥細胞中表達增加,并有望成為逆轉腫瘤耐藥的新靶點[43].

然而,最先應用于臨床的去甲基化藥物--氮雜胞苷與地西他濱--最初的研發并不是基于DNMT的,后來發現其去甲基化作用而分別在2004年和2006年被FDA批準用于惡性血液系統的治療并取得了較為理想的療效[44,45].而針對諸如肺癌等實體腫瘤的研究仍處于臨床試驗階段,且主要與其他藥物聯合進行,如小劑量的氮雜胞苷與恩替諾特聯合應用治療晚期NSCLC不僅增加患者的生存期,同時提高腫瘤對化療藥物的反應[46].而單獨應用去甲基化藥物受限的原因在于其大劑量應用時的細胞毒性和較短的半衰期導致的難以長期維持低濃度持續發揮作用.Guadecitabine(SGI-110)作為新的去甲基化藥物,是地西他濱的前提物,其水溶液更為穩定,目前正在進行惡性血液系統疾病的臨床試驗,Kuang等還發現其誘導肝癌細胞對奧沙利鉑敏感[47].2011年進入I期臨床試驗的RRx-1是一種新的表觀遺傳藥物,可同時抑制DNMT1、DNMT3a和HDACs(histone deacetylases)表達.2015年I期臨床試驗結束證明了其具有較寬安全治療窗和良好的耐受性,目前正在招募包括罹患SCLC和NSCLC在內的受試者進行II期臨床試驗[48,49].其他進展主要是與其他抗腫瘤方式聯合進行治療研究[50].

總之,在表觀遺傳其他方面迅猛發展的大背景下,對于針對肺癌等實體腫瘤的表觀藥物研發進展情況并不理想.對現有藥物的進一步修飾以提高藥物的靶向性而降低藥物不良反應是下一步需要做的工作[45].作者認為藥物研發的思路也許需要做一個轉換,針對腫瘤全基因組水平低甲基化狀態與局部基因啟動子區的高甲基化狀態,我們不能只針對高甲基化狀態去開發去甲基化藥物,針對低甲基化狀態去開發促甲基化藥物也是一個需要研究的方向,甚至對甲基化進行雙向調節維持平衡藥物進行研發也是一個方向.而且去甲基化機制的研究很可能會促使新的藥物靶點發現與開發.原癌基因啟動子區被誘導為高甲基化狀態后基因表達失活同樣可以抑制腫瘤生長,當然進一步的研究仍需要大量困難需要克服.目前,表觀遺傳研究領域前沿的某些專家也在呼吁關注并研究以前忽視的非編碼序列[51].或許,我們在甲基化藥物研發上也該轉換思路了.

2 組蛋白的甲基化修飾在肺癌領域的應用

組蛋白修飾是表觀遺傳學研究的另一重要內容,不同的組蛋白因為其末端氨基酸不同而出現不同類型的修飾,包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等[8,52].其中組蛋白的乙酰化和磷酸化修飾是可逆的,而且對基因轉錄的作用相互拮抗.組蛋白甲基化是由組蛋白甲基化轉移酶(histonemethyl transferase, HMT)完成的.不同于DNA甲基化所導致的基因表達沉默的是,組蛋白甲基化對基因表達可產生激活/抑制的作用,如H3-K9、H3-K27、H4-K20甲基化會抑制基因表達,而H3-K4、H3-K36、H3-K79甲基化則具有激活效應[53,54];而且不同類型(單/雙/三甲基化)的甲基化作用也不一樣.此外,組蛋白甲基化和DNA甲基化可能共同參與基因表達過程[55,56].

2.1 組蛋白甲基化與肺癌診斷 目前關于組蛋白甲基化的研究主要集中在基礎機制領域,與臨床應用相關的研究涉及相對較少,而且多是與其它相關研究共同進行.比如,基于H4KA16乙酰化缺失和H4KM20三甲基化是腫瘤普遍特點的特性,Li等研究了H4KA16、H4KM20及Ki67在肺神經內分泌腫瘤特點,發現H4KA16與H4KM20的進行性損失與腫瘤級別有關,并反映了腫瘤細胞的分化和增殖活性的程度.認為這些組蛋白修飾可以作為腫瘤生物標志物幫助臨床診斷和預后評估[57].H3-K9的組蛋白甲基化轉移酶KMT1E/SETDB1協同TGFβ調節復合物SMAD2/3在肺癌轉移上發揮抑制作用[58].ávila-Moreno等研究發現MEOX2和TWIST1的過表達與H3K27me3和H3K4me3水平相關,在前者低表達而在后者高表達,進一步研究證實可依此幫助判斷NSCLC患者的化療藥物耐藥性和預后[59].在診斷、預后評估等方面的研究應用與DNA甲基化所做工作類似,只是研究工作沒有DNA甲基化廣泛.

2.2 與肺癌相關的調節組蛋白甲基化藥物 與DNA甲基化修飾及組蛋白乙酰化/磷酸化修飾不同的是,組蛋白甲基化一度被認為是不可逆的,這就降低了其在藥物開發領域的應用價值,直到2004年LSD-1(lysine specific demethylase 1)的發現證實存在組蛋白去甲基化酶(histone demethylase, HDM)后[60].有研究提示抑制LSD1在SCLC臨床前研究模型中顯示出細胞增殖減少、腫瘤干細胞維持降低,同時促進細胞分化并抑制腫瘤生長.因此LSD1有望成為SCLC的治療靶點以改善其不良預后[61].

目前針對HDM及HMT的藥物研發工作已大量開展,現主要有三類藥物:第一類是EZH2(enhancer of zeste homolog 2)抑制劑,EZH2是多梳家族蛋白(polycomb-group proteins)中PRC2的催化核心的亞基;PRC2具有HMT活性,對X染色體的失活具有作用[62].EZH2在包括肺癌在內的多種實體腫瘤表達過度,從而誘導腫瘤細胞的遷移、聚集,相反在正常組織極少表達,因此還有作為腫瘤標志物的潛能[63].Fillmore等研究發現,通過抑制EZH2可以使具有BRG1和EGFR突變的NSCLC對依托泊苷敏化[64].最近,Eric E. Gardner等利用EZH2抑制劑--EPZ011989,在小鼠PDX模型(patient-derived xenograft models)上成功地預防了SCLC獲得性耐藥的發生,并在耐藥和敏感模型上均提高了療效[65].第二類是DOT1L抑制劑,DOT1L同樣是一種HMT,催化H3K79的甲基化,同樣有針對血液系統腫瘤的藥物進入臨床試驗[66].第三類是HDM抑制劑,如上一段提及的抑制LSD-1,現已研發出作用于LSD-1的抑制劑GSK2879552,已作為一種新的有效的高選擇性可口服的藥物進入SCLC的臨床試驗,并在體內和體外均顯示出抗腫瘤活性,且DNA低甲基化特征可作為其生物活性的預測因子[67].未來可能同樣會根據表觀遺傳標志物檢測結果進行藥物選擇并聯合傳統化療藥物進行抗腫瘤治療.

3 展望

表觀遺傳學研究近十余年來蓬勃發展,尤其在腫瘤研究領域進展迅速.但仍有一些問題需要去解決:從基礎醫學角度來講,腫瘤與甲基化因果關系的闡明需要有效的動物模型,動物模型建立后對腫瘤的發生機制認識與抗腫瘤藥物的研發大有裨益.從流行病學角度來講,飲食與基因組甲基化水平的關系需要得到進一步研究,低/高甲基化飲食對體內基因組甲基化水平的是否有直接影響,已經有研究團隊對比了孕期高甲基化攝入孕婦與正常飲食孕婦生產后子代體內甲基化水平并得到陽性結果[68],這對指導具有表觀遺傳變異患者的飲食大有裨益,當然這仍需要更為深入的研究.從肺癌的高危因素吸煙角度,已經有團隊做了吸煙與特定基因甲基化水平的隊列研究[69],這對揭示DNA甲基化、吸煙、肺癌三者之間關系的研究以及肺癌的早診與治療均能提供很好的線索.從臨床流行病學角度來講,患有與低甲基化攝入有關的疾病(比如巨幼細胞性貧血)的患者在腫瘤的發生、發展、病理類型或表觀遺傳改變是否與其他人群有差異,同樣需要大量工作要做.隨著認識的深入,結合精準醫學的概念,從甲基化角度出發,人類有希望取得更大的突破,使得包括肺癌在內的廣大病患的病痛得以緩解甚至根除.