Hippo信號通路在肺癌中的研究進展

劉悅超 邢影 蔡莉

肺癌是癌癥相關死亡的主要原因之一,據世界衛生組織稱,肺癌已成為當前全世界范圍內最常見的癌癥,每年能導致約160萬人死亡,肺癌主要起源于支氣管粘膜上皮,其中約85%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),其余為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)[1].雖然當今醫療技術水平不斷提高,肺癌的總體預后并無明顯改善,5年生存率仍低于15%,即使早期接受根治術的患者,仍然存在極高的復發幾率,因此為進一步改善肺癌預后,迫切需要確定探索更多高效的治療靶點藥物[2].研究人員逐漸發現Hippo信號通路出現在肺癌形成進展過程中,本文旨在概括Hippo信號通路中核心效應因子及其上下游靶點的異常表達對肺癌細胞的增殖、自我更新及侵襲遷移所發揮的重要作用.

1 Hippo信號通路概述

Justice等[3]于1995年首次發表了果蠅中Warts(Wts)基因的相關研究結果,并提出該基因對器官形狀與大小具有調控作用,自此人們逐漸開展對Hippo信號通路的實驗研究.果蠅中,Hippo信號通路是一種阻礙細胞生長的抑制性信號通路,該通路的重要成員LATS及Wts可以調控細胞增殖、器官大小及穩態,逐漸人們對Hippo信號通路的功能和調控有了更深入的認知.當果蠅中Hippo信號通路激活時,絲/蘇氨酸激酶使Hpo發生磷酸化,并與Sav、Mob形成復合物,使Mats進一步磷酸化,并激活絲/蘇氨酸激酶Wts.活化的Wts發生磷酸化,同時使Yki磷酸化,并與細胞質中14-3-3蛋白結合,最終導致磷酸化的Yki無法易位到細胞核中[4].因此,Hippo信號通路能夠抑制Yki轉錄靶基因的表達,從而抑制Yki相關效應基因的轉錄.Yki具有調控細胞增殖和細胞周期的功能,因此Hippo信號通路對維持器官穩態發揮重要作用(圖1A).

Hippo信號通路在進化中高度保守,在哺乳動物中,該通路的主要構成元件包含MST1/2、LATS1/2、YAP/TAZ等.Hippo信號通路激活后,MST1/2作為此激酶鏈的核心組件首先被激活,引起下游基因LATS1/2的磷酸化.LATS1/2主要通過阻滯細胞周期進程從而抑制腫瘤細胞的增殖遷移能力,并在介導細胞凋亡中發揮重要調控作用.LATS1/2作為YAP/TAZ的上游基因使二者發生磷酸化,因此磷酸化的YAP/TAZ增多,進而使易位到細胞核中的去磷酸化的YAP/TAZ量減少,與核內TEA域家族轉錄因子(TEA domain family members, TEAD)結合減少,抑制靶向基因轉錄,并最終抑制器官大小、腫瘤細胞增殖和轉移等過程[5].YAP/TAZ能夠激活多種轉錄因子,包括TEAD家族成員、OCT4、p73及ZEB1等[6](圖1B).

近年來,針對Hippo信號通路在腫瘤發生發展中的研究逐漸深入,文獻[7-9]報道Hippo信號通路參與肺癌、膽管癌、結腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的進展過程.Lamar等[10]發現乳腺癌及黑色素瘤中YAP的過表達,可導致腫瘤細胞遷移能力增強、中心型黏附下降、出現間質表型并啟動上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程.

2 Hippo信號通路在肺癌中的作用

2.1 Hippo信號通路的核心組件與肺癌

2.1.1 MST/MOB MST1(mammalian STE20-like kinase 1)能夠編碼絲氨酸蘇氨酸激酶,是59 kDa的II類激酶,其氨基酸序列與MST2具有76%的同源性,具有腫瘤抑制功能,二者的過表達可抑制NSCLC細胞的增殖、促進細胞凋亡[11].通過體內及體外實驗證實,人類NSCLC細胞系A549轉染MST1基因的重組真核表達載體后,MST1的過表達促使YAP發生磷酸化,抑制細胞增殖,并誘導A549細胞發生凋亡[11].而在另一種NSCLC細胞系H1299中敲除MST1基因后,促使突變型p53獲得抗凋亡功能,證實MST1基因可以抑制肺癌細胞發生增殖[12].Hippo信號通路另一個核心組件MOB(Mps one binder kinase)的mRNA表達在63%的NSCLC患者中明顯降低,而在成年小鼠肺中MOB的敲除將導致細支氣管細胞和細支氣管肺泡干細胞(bronchioalveolar stem cells, BASCs)從基底膜脫離,有效抑制腫瘤發生;敲除MOB基因的轉基因小鼠的支氣管上皮細胞中,獲得干性的細胞數目增加,通過對YAP/TAZ以及效應基因NKX2.1的調控,可促進支氣管上皮細胞分化及腫瘤的形成[13].因此,MST/MOB作為Hippo信號通路的核心組件對于抑制肺癌生長具有重要價值.

2.1.2 LATS1/2 除MST/MOB外,Hippo信號通路的構成元件LATS1/2是肺癌發生發展過程中重要的腫瘤抑制因子.LATS1/2是Dbf2相關的核蛋白激酶家族成員,與Hippo信號通路在果蠅中的Wts屬于同源物.Malik等[14]發現,LATS1過表達能夠抑制裸鼠NSCLC細胞的增殖、非貼壁生長及腫瘤形成.人類肺癌細胞H460細胞中LATS1的表達上調了BAX蛋白水平從而促進腫瘤細胞凋亡,而用小干擾RNA敲除NSCLC細胞中的LATS1基因可明顯增強細胞增殖及遷移能力;LATS1的同源異構體LATS2對腫瘤細胞同樣具有抑制增殖及遷移的功能[15].在臨床肺癌組織樣本研究中,LATS1在大多數NSCLC癌癥患者中呈現低表達狀態,并且其低表達與臨床TNM分期、淋巴結轉移及患者生存率緊密相關;大多數NSCLC患者中LATS2表達也降低,且突變比例不到10%,經Cox單因素和多因素回歸分析,LATS2 的表達水平是肺癌患者預后的獨立預測因子[16].此外,Moroishi等[17]研究證實LATS1/2激酶在腫瘤免疫過程中也具有阻礙腫瘤生長的作用,在宿主抗腫瘤免疫反應的誘導下,腫瘤抑制因子LATS1/2發生失活使腫瘤的免疫能力增強,證明Hippo信號通路能夠調節腫瘤免疫原性,從而揭示在癌癥免疫治療中靶向針對LATS1/2位點將有效提高腫瘤治療效果.

2.1.3 YAP/TAZ Hippo信號通路的效應分子YAP、TAZ均為肺癌的致癌基因,二者均定位于人類11q22染色體上,并在NSCLC中呈過表達.有70%的NSCLC細胞系中存在TAZ過表達,在正常支氣管上皮細胞HBE135細胞中,TAZ過表達能夠使非致瘤性的上皮細胞轉化為高致瘤性細胞;而敲除TAZ后,效應基因CTGF及細胞周期調控蛋白Cyclin A表達明顯降低,細胞周期停滯在G0期-G1期,抑制了NSCLC細胞體外非貼壁生長能力及體內的成瘤能力[18].相似的結果也在TAZ的同源異構體YAP中發現,YAP的激活能夠加速細胞增殖、抑制細胞凋亡,導致細胞接觸性抑制喪失并促進細胞惡性轉化,有效推進小鼠體內肺癌進展過程[19].YAP/TAZ的過量表達使肺癌細胞遷移能力增強,并誘導其發生EMT過程,小鼠體內模型也證實YAP/TAZ的激活能夠促進肺癌形成及轉移過程的發生[20].除此之外,超過60%的NSCLC患者存在TAZ基因過表達,且與低分化、淋巴結及遠端轉移、不良預后相關;60%-70%的NSCLC患者存在YAP過表達,并與臨床TNM分期、淋巴結轉移及患者生存率密切相關[21].肺腺癌患者YAP的表達水平比肺鱗癌患者高,這是由于YAP受LKB1激活后可抑制肺腺癌細胞向鱗狀細胞轉化.

總之,Hippo信號通路的核心組件MST/MOB、LATS1/2、YAP/TAZ等均為腫瘤抑制因子或致癌因子,且在肺癌形成過程中發揮重要角色,參與調控肺癌進展的多步驟復雜過程.

2.2 Hippo信號通路的上游調節因子與肺癌

2.2.1 LKB1 肝臟激酶B1(liver kinase B1, LKB1)是一種絲/蘇氨酸激酶,具有腫瘤抑制作用.LKB1能夠調節能量代謝、細胞極性和增殖,從而促進肺癌的進展.研究[22]證實,LKB1是Hippo信號通路核心組件YAP的重要上游調節因子.LKB1能夠通過MARKScrib信號通路激活Hippo信號通路,導致YAP蛋白失活,最終抑制肺癌細胞生長,而敲除YAP后,抑制了LKB1缺失所誘導的肺癌細胞成瘤能力[22].隨后實驗表明,YAP能特異性地被LKB1缺失所激活,抑制ZEB2依賴的DNp63表達,進而抑制鱗癌向腺癌的轉化[23].有研究稱由于LKB1本身是一個抑癌基因,并不是理想的藥物靶點,因此其下游蛋白逐漸成為肺癌治療的潛在靶點,LKB1作為Hippo信號通路的關鍵調節因子,可以抑制肺癌的進展[24].

2.2.2 RASSF1A RASSF1A(Ras-associated domain family 1A)是RAS相關結構域家族支架蛋白的主要成員之一,通過調節細胞周期進程和細胞凋亡發揮腫瘤抑制作用[25].現已明確抑癌基因RASSF1A在肺癌中表達失活是由于啟動子區CpG島的特異性高甲基化所致[26].30%-50%的NSCLC患者中可檢測到RASSF1A的表達減少,并且RASSF1A甲基化是NSCLC術后患者不良預后的獨立預測因素.RASSF1A作為Hippo信號通路關鍵的上游調節因子,可在DNA損傷后由ATM激活,隨后通過激活MST2而誘導腫瘤細胞死亡[25].在DNA復制過程中,RASSF1A可被ATR激酶激活,進而激活LATS1-Cdk2-BRCA2信號通路以維持基因組穩定性,而ATR-RASSF1A-MST2-LATS1信號軸的干擾會造成基因組缺陷,導致肺癌細胞基因組穩定性減弱、促進腫瘤發生[27].因此,在肺癌的發生及進展過程中,RASSF1A在Hippo信號通路調控細胞凋亡及基因組失去穩定性方面至關重要.

2.2.3 microRNAs microRNAs(miRNA)是小非編碼RNA(19個-22個核苷酸),mRNA的3'-UTR特異性結合靶蛋白導致靶基因蛋白表達降低.研究[28]指出,miRNA既具有致癌基因也具有腫瘤抑制基因的作用,同時參與肺癌的形成及轉移過程.

圖 1 Hippo信號通路.A:果蠅中的Hippo信號通路;B:哺乳動物中的Hippo信號通路[43].Fig 1 Hippo signaling pathway. A: The Hippo signaling pathway in drosophila; B: The Hippo signaling pathway in mammalian[43].

miR-31是在肺癌中呈現過表達的致癌基因,敲除miR-31會抑制肺癌細胞生長和成瘤能力,并且miR-31可使小鼠及人類肺癌組織中LATS2表達減少,引起肺部腫瘤發生.肺轉移的miRNA篩選研究發現,miR-135b具有抑制Hippo信號通路的核心成分LATS2和MOB1表達的特點,從而使NSCLC細胞表現為高侵襲性,在miR-135b過表達的NSCLC細胞中敲除TAZ,將明顯降低癌細胞侵襲和集落形成能力[29].在NSCLC患者樣本中,miR-135b過表達與LATS2、核中TAZ的低表達及患者較差的生存率密切相關[29].總之,上調miR-31和miR-135b可通過抑制Hippo信號通路,進一步促進肺部腫瘤發生和進展.除此之外,近來研究發現Hippo信號通路中的YAP/TAZ能夠上調miR-25、miR-93、miR-106b的表達,最終抑制p21基因表達并促進肺癌進展[30].而miR-335通過增強多藥耐藥過程,激活Hippo信號通路,最終抑制肺癌發展[31].

2.3 Hippo信號通路的下游調節因子與肺癌

2.3.1 LATS1/2的下游靶點 抑癌基因p53、凋亡蛋白Bcl2和Bcl-XL等為LATS1/2的下游靶點,這些基因可以通過抑制細胞周期調節劑Cdk1/細胞周期蛋白B(Cdk1/Cyclin B)及Cdk2/細胞周期蛋白E (Cdk2/Cyclin E)兩種復合物,誘導肺癌細胞發生凋亡,抑制肺癌細胞增殖[32].另外,LATS1可通過調控下游靶點Cdk2,促使BRCA2磷酸化、促進基因組的穩定性,抑制肺癌的發展[33].然而,LATS1/2如何調節p53、Bcl2和Bcl-XL的機制尚不明確.

2.3.2 YAP/TAZ的下游靶點 TTF1即NKX2-1,作為Hippo信號通路中YAP/TAZ的下游靶點,調節正常肺組織生長[31].與TAZ及YAP類似,TTF1也具有致癌基因功能,并在肺腺癌中過表達.TAZ能夠直接結合并激活TTF-1,進而激活下游靶點,如肺上皮細胞中的表面活性蛋白C(surfactant protein C, SP-C)靶點[34].這些研究闡明YAP/TAZ與轉錄因子TTF1相互作用,在肺腫瘤發生過程中調節下游效應因子的轉錄,從而調控肺癌的惡性行為.除此之外,AXL、Cyr61、AREG和EPR均已被證實能夠參與YAP/TAZ誘導的肺部腫瘤發生和轉移[35].

3 Hippo信號通路中的藥物靶點

針對Hippo信號傳導通路核心因子所研發的新興腫瘤藥物,如MST1/2小分子抑制劑(XMU-MP-1)、YAP靶點藥物(維替泊芬)等藥物的發現,對腫瘤的靶向治療具有重要作用,為提高肺癌存活率提供新的治療策略.

已有基礎研究為Hippo信號通路的臨床前和臨床應用提供了理論基礎,研究發現MST1/2小分子抑制劑(XMU-MP-1)能夠選擇性地結合MST1/2位點并抑制其表達,從而使YAP的表達水平增高,促進小鼠肝臟修復,在肝臟再生模型中發揮重要功效,進而使針對MST1/2靶點的特異性藥物XMU-MP-1可能成為再生醫學研究及組織修復的新型治療手段[36].研究證實,給予子宮內膜癌HEC-1-B細胞以維替泊芬處理后,免疫熒光染色及Western blot實驗均證明細胞核中YAP表達明顯下調,HEC-1-B細胞存活率顯著降低,腫瘤的增殖受到抑制[37].維替泊芬能通過抑制YAP及NF2的表達從而縮短視網膜母細胞瘤細胞的生存時間,證實維替泊芬通過阻斷 YAP-TEADs間相互作用,以達到抑制腫瘤的治療目的[38].Jiao等[39]模擬YAP的天然拮抗劑VGLL4的結構,設計出一種超級-TDU多肽,能與YAP競爭性結合TEAD位點以抑制YAP的表達,并在胃癌動物模型及MGC-803等胃癌細胞系中證實超級-TDU多肽干擾YAP-TEADs復合物的形成能力使YAP-TEADs作用的下游靶基因CTGF、CYR61及CDX2的表達發生下調,進而抑制胃癌細胞的增殖能力,減小裸鼠胃癌腫瘤的大小,因此超級-TDU多肽對YAP相關的惡性腫瘤具有重要的治療作用.除此之外,維替泊芬通過特異性地阻止易位入核的YAP與TEAD位點結合,增強了肺癌細胞系H1975細胞對靶向藥物厄洛替尼的敏感性[40],為臨床應用中逆轉厄洛替尼耐藥提供新方法.目前隨著YAP/TAZ誘導NSCLC細胞上皮-間質轉化、促進轉移、促進干細胞特性獲得、調控凋亡等相關研究逐漸深入[19],設計針對Hippo信號通路的分子靶向藥物,必將為肺癌轉移的分子診斷和精準治療提供新的視角,也使Hippo信號通路具有重要的臨床意義.

4 總結與展望

Hippo信號通路由多種腫瘤抑制因子構成激酶鏈,調控腫瘤細胞增殖和凋亡之間的動態平衡,以達到抑癌的最終目的.本篇綜述總結了Hippo信號通路的核心組件及其上下游調節因子在肺癌形成及進展中的重要作用.此外,Hippo信號通路在形成肺癌干細胞過程中發揮重要作用,這對于未來探究Hippo信號通路如何參與肺癌干細胞發育過程具有指導意義[41].而后,Hippo信號通路與Wnt、Notch等多條信號轉導通路之間存在相互作用關系,目前已發現Wnt通路與肺動態平衡緊密相關[42],因此進一步探索Hippo信號通路與這些信號通路相互作用關系及如何調節肺發育、腫瘤發生及轉移的分子機制尤為必要.

同時仍有許多問題有待進一步探究,如肺癌晚期Hippo信號通路與腫瘤微環境的相互作用、解決肺癌治療過程中的耐藥問題等等.未來Hippo信號通路有望對改進當前肺癌的治療方案產生更加深遠的影響,它在癌癥中所發揮的重要角色使我們開始思考,如何把Hippo信號通路應用成為阻滯肺癌進展的有效方法和有利手段,設計臨床新靶點治療藥物,從而為臨床上肺癌的診斷、治療及防治開辟新思路.