蜂蜜中抗菌活性物質的研究進展

吳雨祺 鄭宇斐 張言政 胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

蜂蜜中抗菌活性物質的研究進展

吳雨祺 鄭宇斐 張言政 胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州310058）

蜂蜜作為外用殺菌藥物曾有著悠久的應用史，但隨著現代醫學的發展，蜂蜜在醫學上的應用逐步減少。近年來，隨著病菌抗藥性的不斷提高以及蜂蜜對耐藥病菌有效的殺菌作用，人們重新產生了將蜂蜜用于醫療領域的興趣。但是，由于我們對蜂蜜抗菌物質組成及其作用機制缺乏了解，嚴重阻礙了蜂蜜在醫學上的有效應用。本文綜述了近年來在這一方面的相關研究，包括蜂蜜的抗菌活性成分的鑒定，以及這些抗菌活性物質可能的抗菌作用機制，以期為蜂蜜抗菌活性的進一步研究與應用提供參考。

蜂蜜；抗菌活性物質；作用機制

蜂蜜有著廣為人知的抗菌功效，在古代，就曾被廣泛運用于傷口的處理與保護[1]。近現代更是有大量的科學研究都指出蜂蜜可以有效地抑制致病菌的增殖[2-5]，顯示蜂蜜在醫療抗菌領域有著良好的應用價值。但是隨著現代醫學的發展，因其抗菌機制不明確以及現代抗生素的不斷發展等多種原因，蜂蜜逐漸被抗生素所替代。近年來，隨著抗生素研發的放緩和細菌抗藥性的不斷提升，將蜂蜜重新應用于醫學領域又受到了人們的關注，而蜂蜜對耐藥菌的有效抑菌效果[6,7]更進一步提升了人們的興趣。為了探明蜜蜂抗菌成分的作用機制，以便將蜂蜜更好地應用于醫療領域，近年來大量學者對蜂蜜的抗菌組分及其作用機制進行了深入的探索與研究。本文對相關的研究進展進行綜述，以期為蜂蜜抗菌活性成分的進一步研究與應用提供參考。

1 蜂蜜的理化性質

成熟蜂蜜的理化性質就決定了蜂蜜是一種非常不適合細菌生長和繁殖的物質。糖類是成熟蜂蜜的主要成分，以果糖和葡萄糖為主，占蜂蜜總重量的約80%，高濃度的糖類成分使得成熟蜂蜜有著極高的滲透壓，極度不利于微生物的生長與繁殖。此外，成熟的蜂蜜中還含有以葡萄糖酸為主的多種有機酸，使得成熟蜂蜜的pH值偏酸性（3.4至6.1）[8]，能有效抑制細菌生長。

但是大量的研究都發現，成熟過程中的蜂蜜或大比例稀釋后的成熟蜂蜜，仍保留有一定程度的抑菌能力，這意味著除了高滲透壓和低pH值這些理化因素外，蜂蜜一定還有其他的抗菌手段。進一步研究發現，蜂蜜中的多種抗菌活性物質對蜂蜜的抗菌活性有著重要的作用。

2 蜂蜜中的抗菌活性物質

2.1 H2O2

過氧化氫（H2O2）是蜂蜜中第一個被鑒定出來的抗菌物質，蜂蜜中的H2O2主要由蜜蜂摻入花蜜中葡糖氧化酶生成[9]。H2O2被認為可以保證蜂蜜在未成熟前不會因微生物的原因腐壞變質。隨著蜂蜜成熟度的提高，葡糖氧化酶會逐步失活，但隨著蜂蜜重新被稀釋又能再次激活[10]。有研究指出，在將成熟蜂蜜稀釋到原蜜濃度30~50%時，H2O2有著最高的累積速率量[11]。

不同蜜源和產地的蜂蜜中的含量有著顯著差異，有的蜂蜜甚至不含有H2O2（比如新西蘭麥盧卡蜂蜜）[12,13]，造成這一現象的原因尚無定論。有學者認為可能是由于來自植物花蜜的H2O2導致蜂蜜中H2O2含量有差異[14]；也有觀點認為來自植物的葡糖氧化酶導致了這一差異[14]；有學者則認為可能是來自植物的過氧化氫酶降解了蜂蜜中的H2O2[15]，但到目前為止沒有在蜂蜜中檢出過氧化氫酶的報道。

2.2 甲基乙二醛

采自麥盧卡樹（Leptospermum scoparium）的麥盧卡蜂蜜因其良好的抗菌活性聞名于世，Molan等[3]最早報道了麥盧卡蜂蜜的抗菌活性物質，并將其命名為“獨麥素”（unique manuka factor,UMF），但是當時并不能確定是何種物質。

2008年，Mavric等[16]通過檢測發現麥盧卡蜂蜜中含有濃度很高的抗菌物質甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）（38~761 mg/kg）；進一步體外抑菌試驗顯示，MGO抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為1.1 mM，麥盧卡蜂蜜被稀釋至原蜜濃度的15~30%時，其相應的MGO濃度為1.1~1.8 mM時也表現出抑菌活性，這表明麥盧卡蜂蜜的抗菌活性與MGO密切相關。

針對麥盧卡蜂蜜中MGO來源的研究顯示，麥盧卡蜂蜜中的MGO是源自麥盧卡花蜜中的二羥基丙酮（dihydroxyacetone,DHA）[17]，這一轉變過程隨著蜂蜜的儲存緩慢自發進行而不需酶的參與。新鮮的麥盧卡蜂蜜中含有較低濃度的MGO和較高含量的DHA，隨著儲存時間的延長，DHA的含量逐漸降低而MGO的含量逐漸升高，且麥盧卡花蜜中只能檢測到DHA而檢測不到MGO的存在[18]。

為了研究MGO的作用機制，Rabie等[19]將不同濃度的MGO作用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。當暴露于接近MIC濃度的MGO時，細菌的菌毛和鞭毛會受損，并且數量會明顯減少，此外在高濃度下還能觀察到明顯的細胞膜損傷。Roberts等[20]的研究也指出麥盧卡蜂蜜能抑制鞭毛相關基因的表達。Henriques等[21]用麥盧卡蜂蜜處理銅綠假單胞菌后用掃描式電子顯微鏡觀察發現細菌結構完整性、形狀和表面結構發生了顯著變化，并且發現細菌胞體的大量破碎和溶解，確定麥盧卡蜂蜜對銅綠假單胞菌有抑制作用。Maddocks等[22]研究發現麥盧卡蜂蜜能夠抑制釀膿鏈球菌細胞膜的形成并且減少其兩種纖維連接蛋白的表達，從而發揮抑制作用。綜合目前的研究，MGO能破壞或抑制細菌鞭毛和菌毛的產生，降低病菌的粘附能力和運動能力，在高濃度下還能導致細菌溶解，進而抑制病菌的生長與繁殖。

有研究指出，MGO對蜂蜜中的蛋白質和多肽（比如產生過氧化氫的葡萄糖氧化酶）的結構和功能有著不利的影響[23]，這很有可能是麥盧卡蜂蜜中檢測不到H2O2的主要原因。

2.3 植物源多酚類物質

除了轉化自DHA的MGO外，蜂蜜中來自植物的多酚類物質也表現出了一定的抗菌活性。María Inés Isla等[24]使用氯仿∶乙酸乙酯（4.4∶0.6）為展開劑，將阿根廷蜂蜜樣本和從中提取的多酚類物質在薄層色譜上展開，然后在薄層色譜板上覆蓋培養基培養細菌，16 h后觀察細菌的生長情況并與蜂蜜薄層色譜展開的圖譜進行比較，在培養基上能看到多個抑菌圈，并且這些抑菌圈的位置與蜂蜜中多酚類物質展開后的位置一致，其中一個抗菌組分被鑒定為松屬素。

2.4 抗菌肽和王漿主蛋白

除了來自植物的抗菌物質外，蜜蜂自體分泌的抗菌活性物質也在蜂蜜中起著重要的作用。

抗菌肽是無脊椎動物的一種重要的先天免疫系統，蜜蜂具有多種抗菌肽，并且這些抗菌肽的抗菌譜有著一定的差異，共同構成了一個廣譜的抗菌系統[25]。防御素-1（Defensin-1）是蜜蜂的一種重要的抗菌肽，主要作用于革蘭氏陽性菌[26]，在血淋巴、胸唾腺[27]和蜂王漿[28]中均有檢出。Kwakman等[29]于2010年首次在醫用級蜂蜜Revamil蜂蜜中檢測到了防御素-1的存在，而在麥盧卡蜂蜜中沒有檢出這一抗菌肽。

蜂王漿和蜂蜜的防御素-1主要來自于工蜂的咽下腺[29]，但有研究指出，在不同蜂王漿和蜂蜜樣品中防御素-1的含量有著明顯的差異[12,26]。考慮到防御素-1能有效作用于幼蟲芽孢桿菌，有學者懷疑防御素-1的分泌與蜜蜂蜂群美幼病的患病情況有關[15]。

Brudzynski等[30]于2015年發現蜂蜜中糖基化的王漿主蛋白（major royal jelly protein,MRJP）也起著抗菌作用。他們首先使用伴刀豆球蛋白A親和色譜分離得到了蜂王漿中的糖蛋白組分，并且確定這些蛋白有著高效的抑制細菌生長和殺菌作用，這些糖蛋白能特異性地連接和聚集細菌細胞并非特異性地造成細菌細胞膜穿透，同時表現出濃度和時間依賴性。針對這些糖蛋白的進一步分離和質譜鑒定顯示起著主要作用的是糖基化的MRJP-1。MRJP-1的序列中包括了多個抗菌肽（Jelleins-1、Jelleins-2和Jelleins-4），這些抗菌肽可能是MRJP-1具有抗菌功能的重要原因[31]。

Brudzynski等[32]還同時將多種臨床上的耐藥性菌株用于檢測蜂蜜糖蛋白成分的抗菌活性，他們從多個不同的蜂蜜樣品中提取了糖蛋白成分用于檢測。結果顯示，這些糖蛋白組分有著一致的抗菌功效并且能有效抑制多種耐藥菌株的生長與繁殖。

3 不同抗菌成分對不同菌株的作用

蜂蜜中多樣而復雜的抗菌活性物質也導致不同蜂蜜對不同微生物的作用效果有著一定的差異。Kwakman等[12]比較了兩種醫用級蜂蜜Revamil蜂蜜和麥盧卡蜂蜜的殺菌效果，結果顯示這兩者對病菌的殺滅能力有著明顯的差異。雖然兩種蜂蜜在24 h內都能完全殺滅測試細菌，但Revamil蜂蜜能在2 h內殺滅枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌，而麥盧卡蜂蜜只對枯草芽孢桿菌表現出這樣的快速殺菌能力。很明顯，這一差異是由這兩種蜂蜜中抗菌活性成分的不同造成的。

為了進一步明確這些抗菌活性成分在蜂蜜抗菌中起到的作用，有學者使用多種方法逐步去除了蜂蜜中的抗菌活性成分H2O2、MGO和防御素-1，通過過氧化氫酶處理去除H2O2，使用醛酮變位酶消除MGO，利用抗體結合的方法去除防御素-1，并將處理后的產物作用于多種病菌進行了檢測。實驗結果顯示，與對照組（稀釋蜂蜜）和空白組（人工配制的糖水）相比，消去任一抗菌活性物質都會導致蜂蜜的抗菌活力下降，但是不同的抗菌活性成分對不同菌株的抗菌效果影響有差異；H2O2對大多數的受測病菌都有著良好的殺菌效果，但不能有效作用于枯草芽孢桿菌；MGO也表現出了廣譜抗菌性；防御素-1的抗菌效力則主要出現在幾種耐藥性病菌上[29]。

4 展望

近年來，細菌的耐藥性不斷提高，甚至出現了超級細菌，因此尋找新的抗菌藥物的需求迫在眉睫。蜂蜜不但是一種有效的廣譜抗菌物質，有報道還指出，蜂蜜具有使耐藥細菌恢復對抗生素敏感性的功能[33]。無論是單獨使用還是和抗生素配合，都有著極高的醫學應用價值。通過進一步的廣泛深入研究，我們不但能為解決當下困擾醫學界的細菌耐藥性問題提供一個解決方案，也能為蜂蜜產業提供一個新的發展方向與思路。為了能合理高效地將蜂蜜應用于醫學治療，國內外學者對蜂蜜中抗菌物質的鑒別和定性做出了卓有成效的貢獻，同時對這些抗菌活性物質的作用機制進行了一定的探索，但是相關的研究仍不完善，還有很多值得進一步深入研究的問題。

目前相關的研究主要集中在醫用級蜂蜜麥盧卡蜂蜜和Revamil蜂蜜上，僅有少數國外研究將目光集中在本土產蜂蜜。我國作為一個產蜜大國，出產多種地理來源和蜜源不同的優質蜂蜜，而這些蜂蜜的抗菌能力、內含的抗菌物質還有待進一步的探索與明確，進而使中國產蜂蜜也能應用于醫療領域。

針對蜂蜜中抗菌活性物質的機理研究雖然已取得了一定的進展，但是相關研究仍顯不足，特別是對蜂蜜中來自蜜蜂的抗菌成分，對這些物質的來源、作用機制、影響分泌的因素等仍缺乏相應的研究。

此外，蜂蜜抗菌能力的評估方法也有待進一步的完善。有研究發現在不同的培養方法下，同一種蜂蜜對白色念珠菌的抗菌效果有著明顯的差異，在使用肉湯稀釋法和瓊脂稀釋法時有著良好的抗菌活性，但使用瓊脂擴散法時卻沒有抑制生長的效果。這顯示不同的試驗方法可能會顯著影響蜂蜜抗菌效果的顯現，進而影響對其抗菌效力的判斷。因此，如何對蜂蜜的抗菌能力進行評價也是一個亟待解決的問題。

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Research progress on antibacterial substances in honey

Wu Yuqi,Zheng Yufei,Zhang Yanzheng,Hu Fuliang
(College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Since ancient times,honey has been used for treatment and prevention of wound infections,with the advent of antibiotics,the clinical application of honey was abandoned in modern medicine.But in recent years, antibiotic resistance is increasing worldwide and the potent activity of honey against antibiotic-resistant bacteria resulted in renewed interest for its application.However,the incomplete knowledge of the antibacterial compounds involved and the variability of antibacterial activity become the major obstacles for applicability of honey in medicine. This review will elaborate on the antibacterial compounds in honey,by summarizing recent researches about activity of these individual compounds,their antimicrobial mechanism and contribution to the complex antibacterial activity of honey.We aim to provide insights for further study about antibacterial substances in honey and further application in medical.

honey;antibacterial substances;antibacterial mechanism

國家蜂產業技術體系專項（CARS-45）

胡福良，E-mail:flhu@zju.edu.cn