肝細胞程序性壞死在肝損傷中的研究進展

賈 巖，金歡歡，李蒙蒙，王 玲，王飛蝦，張晨曦，張 峰, 2, 3，鄭仕中, 2, 3

[南京中醫藥大學1. 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室、2. 江蘇省中藥功效物質重點實驗室、3. 中藥品質與效能國家重點實驗室(培育)，江蘇 南京 210023]

肝臟是機體最重要的代謝和解毒器官，各種致病因子損傷肝臟時，肝臟的正常生理和生化功能將會減弱，最終導致肝病的發生[1]。根據持續時間肝損傷分為急性和慢性損傷。急性肝損傷嚴重時，肝細胞大量壞死或凋亡，導致肝細胞數量急劇衰減，最終引起急性肝衰竭[2]。慢性肝損傷是由于炎癥或細胞內應激反應(如內質網應激和線粒體應激)導致的長期肝臟損傷。常見的慢性肝損傷包括酒精和非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等。急性和慢性肝損傷均能導致肝細胞死亡，一般伴隨血清谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)水平的升高。慢性肝病中持續性的肝細胞死亡將誘發炎癥、肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)活化并轉變成肌成纖維細胞，最終發生肝硬化和肝細胞癌[3]。因此，抑制急性、慢性肝損傷中的肝細胞死亡是修復肝臟或抑制繼發性炎癥和纖維化的重要治療策略[4]。新近研究發現，肝細胞存在程序性壞死(necroptosis)這一新的死亡形式，并且在急、慢性肝損傷中扮演重要角色。該文對近年來這一方面的研究進展作一綜述，旨在為肝病的病理機制與相關治療藥物的研究提供新的視角。

1 細胞程序性壞死的特征與調控機制

2005年，Degterev等[5]正式提出一種受信號分子調控，使細胞在缺乏半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的情況下死亡，具有典型壞死樣形態的新型細胞死亡形式，即程序性壞死。雖然程序性壞死與凋亡有共同的上游分子機制，但是兩者結果不同。程序性壞死的最終結果是線粒體功能障礙，細胞器及細胞腫脹破裂，質膜透化，細胞內含物漏出，周圍組織產生炎癥反應。與凋亡相區別的是，程序性壞死不影響核固縮，不產生核小體DNA片段[6]。

現已發現，死亡受體(death receptor, DR)超家族、Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)等可執行程序性壞死，其中研究最廣泛的是死亡受體超家族誘導的程序性壞死。死亡受體超家族包含腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1, TNFR1)、自殺相關因子(factor associated suicide, Fas)、DR3、DR4等[7]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)是啟動程序性壞死最重要的因子[8]。TNF-α與細胞膜上TNFR1結合，募集細胞內多種蛋白形成復合體I。復合體Ⅰ包括 TNF 受體相關死亡結構域(TNF receptor associated death domain, TRADD)、受體相互作用蛋白激酶1(receptor interaction protein kinase 1, RIPK1)、TNFR 相關因子2(TNF receptor factor 2, TRAF2 )、TRAF5 、胞內凋亡蛋白抑制因子1(cellular inhibitor of apoptosis protein, cIAP1)、cIAP2以及泛素酶復合體。復合體Ⅰ中RIPK1泛素化將激活NF-κB或絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號，進而抑制細胞死亡。當復合體Ⅰ中的TNFR1解離時，RIPK1發生去泛素化，并與RIPK3、TRADD、Fas死亡結構域相關蛋白(fas associated death domain, FADD)及caspase-8形成復合體Ⅱ。復合體Ⅱ中的caspase-8切割 RIPK1，使其失活，RIPK3無法磷酸化，細胞將發生凋亡。如果caspase-8被敲除或抑制，去泛素化的RIPK1和RIPK3通過它們的RIP同型作用結構域(RIP homology interaction motif, RHIM)相互作用，形成一種募集激酶MLKL(mixed-lineage kinase domainlike, MLKL)的復合體[9]。MLKL被RIPK3激活后，磷酸化的MLKL形成四聚體靶向線粒體，產生大量的活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)，導致線粒體通透性改變[10-11]。另有研究表明，MLKL可誘導細胞毒性的鈣或鈉離子流，隨后轉移到細胞膜，導致膜破裂[12]。對于程序性壞死最終是通過線粒體ROS途徑，還是依賴于MLKL誘導形成的通透性孔道，導致細胞死亡尚存在爭議，有待于進一步研究揭示。

2 急性肝損傷中的肝細胞程序性壞死

2.1藥源性肝損傷藥物誘導的肝損傷具有復雜的臨床特征，缺乏客觀的診斷方式。大多數的藥物靶向何種肝臟細胞并不明確，本文主要對研究較成熟的對乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)所致的肝損傷進行總結。APAP使用過量時，可通過影響CYP450系統，進而引起肝細胞毒性，常致急性肝細胞損傷甚至急性肝衰竭。APAP誘導的細胞死亡一直被認為是壞死性的，不依賴于caspase和TNFR。這種死亡方式將導致線粒體功能障礙和ROS產生、ATP消耗、線粒體通透性改變。近來人們認識到，APAP導致的肝細胞死亡是一種細胞壞死的調節性模式，即程序性壞死[13]。

小鼠APAP模型與藥物所致的人肝損傷中，肝細胞程序性壞死程度都明顯增強，肝功能受損。臨床研究發現，APAP誘導的肝衰竭病人肝細胞中出現了程序性壞死特異性標志物，即磷酸化的MLKL，且其磷酸化程度伴隨不同程度的肝細胞壞死，提示肝細胞程序性壞死可能誘導APAP所致的人肝衰竭，而抗癌藥物達拉菲尼(也是一種RIPK3抑制劑)，可以抑制APAP造成的人肝細胞程序性壞死[10,14]。Zhang等[15]發現，小鼠腹腔注射APAP(300 mg·kg-1)1 h后，肝臟發生急性衰竭，RIPK1大量表達；給予RIPK1選擇性抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)預處理，肝細胞壞死減少，肝細胞存活率明顯提高，急性肝衰竭得到明顯改善。進一步研究發現，這些作用與JNK磷酸化及Bax易位被抑制相關。另有研究表明，Nec-1可通過減少肝細胞中ROS的生成，改善APAP所致的肝細胞程序性壞死[16]。利用RIPK3全敲除小鼠的APAP模型，Ramchandran等[17]發現，APAP作用6 h后，RIPK3全敲除明顯減輕APAP(200～300 mg·kg-1)的肝毒性；在APAP作用24 h后，RIPK3全敲除對肝臟的保護作用不明顯。此外，Deutsch等[18]報道，RIPK3全敲除具有抗APAP(700 mg·kg-1)毒性作用，并且小鼠存活率升高。以上結果提示，實驗條件(如APAP制備不同)以及小鼠品系不同造成了結果差異，但均表明RIPK3缺失能夠減輕APAP的肝毒性。因此，藥物調節程序性壞死關鍵因子RIPKs水平可以成為減輕藥源性肝損傷的一個有效策略。然而，Dara等[19]使用MLKL敲除小鼠，給予APAP(300 mg·kg-1)處理，肝損傷并未明顯減輕，這與臨床研究APAP誘導的肝衰竭病人肝細胞中MLKL表達異常的結果相悖，提示我們動物的基因型與人存在一定的差異性，APAP所致的肝細胞壞死可能還依賴于其他機制。因此，需要進一步研究并詳細闡明肝細胞程序性壞死在APAP誘導的肝損傷中的作用。

2.2免疫性肝損傷刀豆蛋白A常用于誘導免疫性急性肝損傷。刀豆蛋白A可以直接激活T細胞，通過免疫系統靶向肝細胞，隨后巨噬細胞、枯否細胞活化，并募集單核細胞至肝臟，造成肝損傷[20]。除了免疫細胞，肝竇內皮細胞通過介導肝臟血液的高凝狀態和炎癥應答參與肝損傷[21]。研究發現，小鼠靜脈注射刀豆蛋白A(25 mg·kg-1)，感染后的早期出現肝細胞凋亡，后期出現大量的肝細胞壞死。刀豆蛋白A感染期間肝細胞內caspase幾乎沒有活性，其誘導的細胞死亡形式主要是壞死性的[22]。

體內研究發現，在小鼠感染刀豆蛋白A前尾靜脈注射Nec-1，與對照組相比，血清中ALT與AST水平及致死率明顯下降[23]。Jouan-Lanhouet等[24]在小鼠感染刀豆蛋白A前給予Nec-1處理15 min，發現血清中ALT水平下降50%，組織損傷也明顯減輕；另外，聚(ADP-核糖)聚合酶-1(PARP-1)的活化減少，表明PARP-1或許是RIPK-1的下游因子。后期研究發現，RIPK1與PARP-1的抑制可以降低肝細胞白介素-33(interleukin-33, IL-33)的表達，減輕肝細胞程序性壞死。因此，抑制IL-33介導的過度性炎癥反應或許是減輕肝細胞程序性壞死的重要舉措。Deutsch等[18]發現，在刀豆蛋白A致肝損傷模型中，RIPK3的敲除使小鼠肝損傷減輕。然而，有臨床研究表明MLKL在自身免疫性肝炎病人的肝臟中上調并且活化，其不依賴RIPK3，而是通過轉錄因子STAT1影響促炎癥因子干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)，發揮細胞毒性作用[25]。最新研究發現，MLKL的敲除使刀豆蛋白A所致的小鼠肝損傷有所減輕。有趣的是，在刀豆蛋白感染肝臟后，RIPK1和MLKL蛋白表達增加，而RIPK3的蛋白表達沒有變化，與臨床研究結果一致[26]。我們推測，程序性壞死可能存在其他的調節因素。MLKL除了介導經典的RIPK3依賴性程序性壞死，還可以介導非典型的程序性壞死途徑，這為臨床治療免疫性肝損傷的新藥研發提供了新的實驗依據。盡管程序性壞死的調控機制需要深入研究，但是其對免疫性肝炎防治具有重要的臨床價值。

3 慢性肝損傷中的肝細胞程序性壞死

3.1酒精性脂肪肝病酒精性脂肪肝病(alcoholic fatty liver disease, AFLD)是過量飲酒引起的肝細胞損傷性疾病。長期酒精攝入可以導致肝臟脂肪變性，誘導脂肪性肝炎，表現為炎癥反應、細胞死亡、肝臟纖維化，最終導致肝硬化甚至肝細胞癌。目前，已有研究發現，乙醇暴露誘導肝細胞程序性壞死，酒精性脂肪肝的發生、發展與肝細胞程序性壞死密切相關。

有研究報道，AFLD病人的肝臟組織中RIPK3的表達異常，肝臟出現一系列的病理改變如肝細胞脂質聚集、轉氨酶升高[27]。在酒精喂養的小鼠肝臟中，RIPK3大量表達，肝臟中央靜脈周圍組織呈RIPK3陽性染色，而RIPK3全敲除小鼠的血清ALT水平下降、脂肪變性程度得到改善[27-28]。Bakhautdin等[29]研究發現，在酒精喂養的小鼠肝臟中，血紅素加氧酶-1可以通過降低RIPK3的表達，減輕肝細胞壞死，改善肝損傷。此外，與對照組相比，RIPK3敲除小鼠肝組織的甘油三酯、TNF-α水平下降，炎癥細胞數量減少，肝臟損傷得到改善，此過程依賴于細胞色素P450 2E1(CYP2E1)介導的乙醇代謝。另有研究發現，姜黃素改善酒精誘導的肝細胞程序性壞死；深入的機制研究發現，Nrf2敲低使RIPK3異常表達，加劇酒精性肝損傷，削弱了姜黃素對肝細胞程序性壞死的抑制作用，說明其依賴于Nrf2/p53途徑[30]。現有的研究結果直接表明，RIPK3是一個關鍵的致肝損傷因子，并明確了肝細胞程序性壞死參與調節酒精性脂肪肝的病理進程，其可能通過抑制肝細胞的炎癥及脂肪變性，減輕酒精性脂肪肝程度。RIPK3特異性抑制劑的研發將有利于AFLD的防治。

3.2非酒精性脂肪肝病非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)與基因、環境、代謝應激等相關，其疾病譜包括肝臟單純性脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝硬化甚至肝細胞癌。NAFLD的發病機制目前還未完全闡明[31]。

研究表明，NASH的病人肝組織中RIPK3和p-MLKL表達增加，而RIPK3敲除明顯減輕蛋氨酸-膽堿飲食小鼠的脂肪變性和炎癥反應[32]。在甲硫氨酸-膽堿缺乏的NASH小鼠模型中，RIPK3表達增加，并且RIPK3的激活由JNK活化介導。有趣的是，肝臟特異性caspase-8敲除小鼠在正常飲食時，肝臟中RIPK3表達增加，肝損傷加重[33]。這可能是在胚胎敲除的動物模型中出現了代償性反應，但是其機制尚不清楚。Alfonso等[32]發現，RIPK3基因敲除可減輕高脂飲食誘導的大鼠肝損傷；后續的體外研究發現，大鼠原代肝細胞中RIPK3的缺失可抑制氧化應激誘導的肝細胞程序性壞死。此外，抑制caspase并不能阻止TNF/CHX誘導的肝細胞凋亡，對肝細胞程序性壞死的研究造成一定的影響。這可能是由于蛋氨酸-膽堿缺乏造成的胰島素抵抗異常，以及免疫組化中使用的抗體是非特異性結合的。這也提示我們蛋氨酸-膽堿缺乏模型不是理想的NASH模型，使用優良的動物模型及特異性抗體，將有利于我們更好地探究肝細胞程序性壞死。另外，NAFLD的發生與發展受多種復雜因素影響，目前肝細胞程序性壞死在NAFLD病理進程中的詳細機制尚不清楚，如能了解肝細胞程序性壞死在NAFLD發生發展各個階段的具體機制，以及與其他信號通路之間的相互作用，就可以通過抑制肝細胞程序性壞死，減輕高脂飲食誘導的肝損傷，為抗NAFLD研究提供新思路。

3.3肝纖維化肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理過程，是肝臟損傷后自我修復的代償性反應。肝損傷時，壞死的肝臟實質細胞釋放多種促炎癥因子，以旁分泌途徑刺激HSC，使其大量增殖并活化，分泌大量細胞外基質成分形成纖維化。隨著程序性壞死在肝病中的研究不斷增多，程序性壞死在肝纖維化中的作用研究成為新的熱點。

最近研究發現，程序性壞死可以調節肝細胞死亡而加重肝纖維化。體內研究發現，小鼠給予蛋氨酸-膽堿缺乏飲食8周后，肝臟中Ι型膠原明顯增加，出現纖維化。Caspase-8敲除后，伴隨大量的RIPK3表達，肝臟纖維化明顯加劇。然而caspase-8/RIPK3雙敲除小鼠的肝纖維化明顯改善，表明程序性壞死加劇NASH誘導的肝纖維化。進一步研究發現，四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導肝細胞程序性壞死，但是caspase-8/RIPK3雙敲除并未明顯改善CCl4導致的小鼠肝纖維化[33]。因此，RIPK3或許介導了脂肪肝相關的纖維化。

Choi等[34]研究發現，褪黑激素可以降低CCl4誘導的大鼠纖維化肝臟中RIPK1、RIPK3、MLKL的表達，還可以抑制HMGB-1、IL-1α的表達。這表明褪黑激素可以通過抑制程序性壞死相關的炎癥信號傳導，改善肝纖維化。體內實驗發現，誘導細胞死亡的化學性抑制劑PJ34(PARP-1抑制劑)和Nec-1能夠降低肝細胞特異性的IL-33的表達，從而減輕肝細胞程序性壞死造成的肝纖維化損傷[35]。由此可見，抑制肝細胞程序性壞死能夠減輕肝纖維化，這一作用可能與抑制炎癥應答相關因子如IL-1、IL-33的表達有關，說明Nec-1具有抑制過度炎癥應答的作用，其對抑制肝纖維化等慢性肝損傷中的炎癥具有良好的應用前景。有研究結果指出，活化型HSC、肝竇內皮細胞中RIPK1、RIPK3大量表達[35-36]。肝臟非實質細胞或許也存在程序性壞死現象，進而誘導肝損傷。因此，RIPKs的缺失對肝臟的保護作用是由于肝細胞內在機制，還是通過影響其他肝臟細胞產生的，尚需進一步研究。但不可否認的是，肝細胞程序性壞死在不同病因誘導的肝纖維化進程中的作用舉足輕重。

4 結論

綜合已有的研究發現，肝細胞程序性壞死在急性和慢性肝損傷的發生與發展過程中均發揮著重要作用，其關鍵性調節因子RIPK1、RIPK3、MLKL可能有助于為臨床肝病治療的藥物篩選提供新的靶標。然而，目前人們對肝細胞程序性壞死的認識尚不全面，如研究肝細胞程序性壞死的動物模型都是在caspase抑制或敲除條件下建立的，對于生理情況下程序性壞死如何發生尚不清楚；肝細胞程序性壞死與其他信號通路之間存在怎樣的相互作用，仍有待加深思考與探究。此外，程序性壞死對肝臟中不同類型的細胞是否作用也不同；藥物對細胞程序性壞死的作用是否是多方面的。有關程序性壞死在肝損傷中的研究還存在許多不足，隨著對程序性壞死的機制及其功能全面而深入的研究，細胞程序性壞死將有可能成為治療肝臟疾病的一個新方向，而開發出能夠靶向調節不同細胞類型程序性壞死功能的藥物，將為肝病防治帶來新的突破。

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