氧化應激對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生的影響

2014-08-28 19:16:54何培新等

湖北農業科學 2014年13期

何培新等

摘要：采用平板覆蓋玻璃紙培養法，初步探討了甘露醇、二甲基亞砜（DMSO）、苯甲酸鈉和N，N-二甲基對亞硝基苯胺等4種羥基自由基清除劑， L-半胱氨酸、還原型谷胱甘肽和β-巰基乙醇等3種巰基化合物和抗壞血酸對粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）菌絲生長和菌核發生的影響。結果表明，作為可以降低真菌胞內氧化應激的活性氧自由基清除劑，測試藥劑對菌絲生長和菌核發生具有抑制作用，且該抑制作用隨著藥劑濃度的增加而增強，較高濃度的添加藥劑可完全抑制菌核發生。隨著測試藥劑的羥基自由基清除能力增強，完全抑制粗柄羊肚菌菌核發生的濃度相應降低，菌絲生長也大致表現出類似的趨勢。測試的較強自由基清除劑苯甲酸鈉、N，N-二甲基對亞硝基苯胺、3種巰基化合物和抗壞血酸改變了粗柄羊肚菌菌落的色澤，表明打破了粗柄羊肚菌正常的生理活動。

關鍵詞：粗柄羊肚菌（Morchella crassipes）；自由基清除劑；氧化應激；菌絲生長；菌核發生

中圖分類號：S646.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3085-05

Effects of Oxidative Stress on Mycelial Growth and Sclerotial Metamorphosis

of Morchella crassipes

HE Pei-xin1，LIU Wei2，CAI Ying-li3，MA Ben-jun1，CHEN Lei-tao1，WU Xiao-rui1

（ 1. School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002，China；

2. Institute of Hydrobiology， Chinese Academy of Sciences， Wuhan 430072， China；

3. Institute of Applied Mycology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：Cellophane-cover plating method was used to study the influences of radical scavengers on mycelial growth and sclerotial metamorphosis of Morchella crassipes. Five hydroxyl radical scavengers （mannitol， DMSO， sodium benzoate and N，N-dimethyl nitrosoaniline）， three mercapto compounds （L-cysteine， glutathione and β-mercaptoethanol） and ascorbic acid were tested. Results showed that the reactive oxygen radical scavengers could reduce fungal intracellular oxidative stress. The chemical agents tested inhibited the mycelial growth and sclerotia occurrence. The inhibition was enhanced with the increase of tested agents. Drugs with high concentrations inhibited completely the occurrence of sclerotia. With the enhancement of hydroxyl radical scavenging capacity， the concentration of scavengers completely inhibited occurrence of the sclerotia reduced accordingly. The effects on mycelial growth were similar. It is indicated that strong free radical scavengers such as sodium benzoate， N，N-dimethyl nitrosoaniline， mercapto compounds and ascorbic acid changed the color of colonies of M. crassipes， indicating the normal physiological activity was interrupted.

Key words： Morchella crassipes； radical scavenger； oxidative stress； mycelial growth； sclerotial metamorphosis

氧化應激（Oxidative stress）是指細胞內氧化增強劑與抗氧化劑之間的平衡向氧化增強的方向變化，高活性分子如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產生過多，超過了細胞的抗氧化能力，造成個體或細胞的氧化損傷[1]。在真菌中，氧化應激會導致DNA、蛋白質和脂肪大分子氧化損傷，誘導細胞循環改變、細胞凋亡和分化的發生。氧化應激會誘導齊整小核菌（Sclerotium rolfsii）等多種真菌菌核分化，通過形成菌核規避氧氣，阻止超氧化狀態的發展，避免對細胞產生更大的損傷[2]。

羊肚菌（Morchella spp.）是一類世界性分布的名貴大型真菌，具有較大的食用和藥用價值。百余年來，國內外對羊肚菌的分類鑒定、自然分布、生理生態、遺傳特性和人工栽培等進行了大量研究。然而，羊肚菌的人工栽培至今仍未得到根本上的解決[3，4]。菌核是多種羊肚菌生活史的必經階段，誘導形成菌核是其人工栽培的基礎[5-7]。關于羊肚菌菌核發生生理學的研究報道較少，沒有發現氧化應激影響羊肚菌菌核發生的系統研究報道。為此，采用平板覆蓋玻璃紙法，初步探討了甘露醇、二甲基亞砜（DMSO）、苯甲酸鈉和N，N-二甲基對亞硝基苯胺等4種羥基自由基清除劑，谷胱甘肽（還原型）、L-半胱氨酸和β-巰基乙醇等3種巰基化合物和維生素族抗氧化劑——抗壞血酸對粗柄羊肚菌（M.crassipes）菌絲生長和菌核發生的影響，以期為深入開展氧化應激影響羊肚菌菌核發育的生理學機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試粗柄羊肚菌菌株組織分離自河南省鄭州市郊區發生的子囊果，經過形態學和分子生物學分析確定其分類地位[8]。

CYM完全培養基：蛋白胨2 g，酵母膏2 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.46 g，磷酸氫二鉀1 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.2 試驗方法

測定了甘露醇（0、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mol/L）、DMSO（0、20、40、100、150、300 mmol/L）、苯甲酸鈉（0、2、6、10、15、20 mmol/L）、N，N-二甲基對亞硝基苯胺（0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mmol/L）等4種羥基自由基清除劑，β-巰基乙醇（0、2、4、6、12、24 mmol/L）、L-半胱氨酸（0、1、5、10、20、40、80 mmol/L）和谷胱甘肽（還原型）（0、1、5、10、20、40、80 mmol/L）等3種巰基化合物以及抗壞血酸（0、30、60、90、120、150 mmol/L）對供試菌株菌絲生長和菌核發生的影響。所有化學試劑均為國產分析純，采用0.22 μm的細菌過濾器過濾除菌。采用直徑9 cm的玻璃培養皿培養、試驗。玻璃紙裁成圓形，直徑略小于9 cm，用10 mmol/L的EDTA-Na2水溶液煮沸 10 min，再用去離子水洗滌2次，121 ℃高壓蒸汽滅菌、備用。供試藥物過濾除菌后，待培養基冷卻至約50 ℃時，與培養基混勻、倒平皿，待培養基凝固后覆蓋玻璃紙。用打孔器打取直徑5 mm的菌絲塊接種于玻璃紙中間，24 ℃恒溫培養。接種塊菌絲的菌齡、厚度和大小保持一致。每天觀測并記錄菌落直徑（mm）和菌株生長發育狀態，按下式計算菌絲生長速度：菌絲生長速度（mm/h）=（菌落直徑-5）/（培養時間×2）。連續培養14 d，統計菌核數量，測量菌核大?。╩m）；揭下含有菌絲體和菌核的玻璃紙，用鑷子將菌核小心取出，50 ℃烘干至恒重，稱重（mg）；將剩余的菌絲刮下、烘干、稱重。每處理3次重復。

1.3 數據分析與處理

采用SPSS 17.0軟件分析和處理數據。所有分析的數據為3個重復的平均值±標準差（SD）。

2 結果與分析

2.1 羥基自由基清除劑對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生的影響

從圖1可以看出，甘露醇對粗柄羊肚菌菌絲生長的影響較小。低濃度（≤0.10 mol/L）時不影響菌絲生長，較高濃度則產生輕微的抑制作用。添加濃度達0.80 mol/L時，菌絲生長速度較對照組低10%左右。甘露醇整體上抑制菌核發育，其抑制效果隨著藥劑濃度的升高而增強，≥0.40 mol/L時完全抑制菌核的發生。此外，在給定的濃度條件下，甘露醇不影響粗柄羊肚菌菌落的色澤。

從圖2可以看出，DMSO對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生的影響強于甘露醇。低濃度（20 mmol/L）的DMSO，菌絲的生長速度和對照組相當；隨著濃度的持續升高，菌絲生長速度平緩降低；最高濃度（300 mmol/L）條件下也沒有完全抑制菌絲體的生長。隨著DMSO濃度的增加，對菌核發生的抑制作用增強；濃度≥150 mmol/L時完全抑制菌核的發生。在測試的藥劑濃度下，沒有影響粗柄羊肚菌菌落的顏色。

從圖3可以看出，苯甲酸鈉對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生產生了較強的影響。隨著藥劑濃度的增加，對菌絲生長的抑制作用增強。15 mmol/L的條件下，24 ℃恒溫培養14 d，菌落未能長滿平板，菌落邊緣不整齊； 20 mmol/L時則完全抑制菌絲體的生長，表現為強抑制作用。濃度2 mmol/L苯甲酸鈉的平板有少量菌核的發生，菌核總重量為10.2 mg；濃度≥6 mmol/L以上時完全抑制菌核的發生。隨著苯甲酸鈉濃度的增加，菌落的顏色逐漸加深。15 mmol/L條件下，菌落顏色為深棕色。

從圖4可以看出，N，N-二甲基對亞硝基苯胺對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生的抑制作用最強。隨著藥劑濃度的升高，菌絲生長速度逐漸下降，菌核數量和總重量逐漸降低。1.5 mmol/L時完全抑制菌核的發生。菌落的顏色隨著藥劑濃度的升高逐漸變淺，濃度1.2 mmol/L下為淺棕色，濃度1.5 mmol/L下為黃白色。

2.2 巰基化合物對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生的影響

從圖5可以看出，谷胱甘肽（還原型）和L-半胱氨酸對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生產生了相似的影響。添加藥劑的濃度為1 mmol/L不影響菌絲的生長，但菌核發生比對照組顯著減少；藥劑濃度升高，對菌絲生長和菌核發生產生了顯著影響，濃度≥10 mmol/L時完全抑制菌核發生。通過藥物處理后的菌落形態和菌核發育狀況可以看出，谷胱甘肽（還原型）對菌絲生長的抑制作用強于L-半胱氨酸，濃度≥10 mmol/L時，24 ℃恒溫培養14 d，添加谷胱甘肽（還原型）菌絲難以長滿平板，菌落邊緣不整齊，菌落的顏色逐漸變淺，最終表現為白色菌落；而添加L-半胱氨酸，菌絲緩慢生長，最終可發滿平板，但菌絲生物量明顯降低，菌落顏色隨著藥劑濃度增高而逐漸變淺，最終為淺棕色至淡黃色。

從圖6可以看出，CYM平板中不同濃度的β-巰基乙醇表現出對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生產生較強的抑制作用。2 mmol/L時菌絲以較低的速度（0.02 mm/h）生長；持續培養14 d，菌絲可長滿平板，菌落淺棕色，氣生菌絲較少。4 mmol/L時強烈抑制菌絲生長，持續培養14 d菌絲未能長滿平板，菌落邊緣不整齊。濃度大于4 mmol/L則完全抑制菌絲生長。所有添加藥劑的平板均沒有菌核發生，表現為對菌核的強烈抑制作用。

2.3 抗壞血酸對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生的影響

試驗結果表明，隨著添加藥劑濃度的增加，抗壞血酸對粗柄羊肚菌菌絲生長的抑制作用增強。濃度為30 mmol/L時，菌絲生長速度（0.07 mm/h）明顯低于對照（0.33 mm/h）；濃度大于120 mmol/L時則完全抑制菌絲生長，表現出對菌絲生長的毒害作用。添加藥劑的平板菌落顏色為淺黃色至乳白色，邊緣不整齊。所有試驗濃度下平板均沒有菌核發生。

3 小結與討論

按照反應速率常數，測試的4種羥基自由基清除藥劑可分為3種類型：甘露醇為弱清除劑，DMSO和苯甲酸鈉為中等清除劑，N，N-二甲基對亞硝基苯胺為強清除劑。N，N-二甲基對亞硝基苯胺通過苯胺環的羥基化清除羥基自由基，清除速率較高；DMSO與羥基自由基反應產生甲基自由基、烷類、甲烷磺酸、甲醛等多種產物；苯甲酸鹽通過其苯甲酸酯環的羥基化或脫羧作用清除羥基自由基；甘露醇為傳統的羥基自由基清除劑，通過形成羥基過氧化氫自由基發揮作用[9]。本研究表明，隨著測試藥劑的羥基自由基清除能力增強，完全抑制粗柄羊肚菌菌核發生的濃度相應降低，菌絲生長也表現出類似的趨勢。羥基自由基清除劑對粗柄羊肚菌菌核發生的影響，與氧化應激誘導真菌菌核發生的假說[2]相一致。該假說已經在齊整小核菌、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小核盤菌（S. minor）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等產菌核的植物病原真菌上得到驗證[10，11]。隨著藥劑自由基清除能力和濃度的增加，對自由基的清除程度加大，降低了胞內氧化應激水平，抑制了菌核的發生。相比而言，DMSO完全抑制粗柄羊肚菌菌核發生及明顯抑制菌絲生長的添加濃度（分別為150 mmol/L和大于300 mmol/L）遠高于自由基清除反應速率常數相近的苯甲酸鈉（分別為6 和15 mmol/L），原因可能是DMSO較難通過真菌的細胞膜，被完全吸收發揮作用的能力更低。類似的結果也見于齊整小核菌等植物病原真菌研究[10，11]。

巰基氧化還原態（Thiol redox state，TRS）是很多主要的生物學過程，特別是氧化應激的必需代謝效應物[12]。還原態（游離巰基）和氧化態（形成二硫鍵）的TRS成分分別是氧化應激低與高的指示劑。L-半胱氨酸含有游離巰基基團，對維持多數抗氧化酶的活性具有重要作用。谷胱甘肽（還原型）是重要抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）的底物。GPX利用谷胱甘肽催化過氧化氫生成水，或使有機氫過氧化物（ROOH）還原為ROH。β-巰基乙醇是潛在的還原分子、抗氧化劑和膜穩定劑。這些巰基化合物均可直接或間接清除自由基，降低氧化應激[9]。本研究表明，測試的3種巰基化合物對粗柄羊肚菌菌絲生長和菌核發生產生了較強的抑制作用，隨著添加濃度的增加，更顯著降低了氧化應激，對菌核發生的抑制作用也加強。該結果與齊整小核菌等植物病原真菌的結果一致[13-15]，也符合氧化應激誘導真菌菌核發生的假說[2]。

抗壞血酸是維生素族水溶性抗氧化劑，可清除多數ROS，如過氧化氫自由基、超氧化物自由基、羥基自由基和單態氧；還能充當脂質抗氧化劑及間接脂質抗氧化劑，恢復維生素E的脂質抗氧化劑性質[9]。本研究表明，一定濃度的外源抗壞血酸對粗柄羊肚菌菌絲生長具有明顯抑制作用，對菌核發生的抑制作用更加顯著。該結果與立枯絲核菌、小核盤菌和齊整小核菌的研究結果一致[16-18]，也進一步驗證了氧化應激誘導真菌菌核發生的假說。

試驗結果表明，較大濃度的供試自由基清除劑對粗柄羊肚菌菌絲生長具有一定的抑制作用，且該抑制作用與藥劑濃度正相關，濃度過大完全抑制菌絲的生長。在齊整小核菌等植病真菌的研究中，也發現類似的結果[2，10-12]。通常情況下，抗氧化劑通過形成有毒的次級自由基產物和最終穩定的副產物而清除自由基[9]。清除劑濃度越高，這些次級自由基的積累也越多，超過了真菌抗氧化機器的中和能力，因而掩蓋了清除劑的抗氧化作用，最終導致真菌死亡[10，11]。該結果可用于開發新型殺真菌劑，較高濃度的自由基清除劑可強烈抑制真菌菌絲生長，打破真菌的生活史。

CYM平板添加較強自由基清除劑（如苯甲酸鈉、N，N-二甲基對亞硝基苯胺、3種巰基化合物和抗壞血酸）會改變粗柄羊肚菌菌落的顏色。羊肚菌菌落顏色的改變是真菌正常生理活動被打破的信號，是自由基清除劑保護性抗氧化應答的表現（色素也具有抗氧化作用）。

與核盤菌等多種植病真菌不同，羊肚菌的菌核沒有明顯分化，因此可稱之為“假菌核”（Pseudosclerotium）。雖然為假菌核，但其發育過程與真菌核相似。菌核形成時，菌絲重復分枝，細胞膨大，細胞壁加厚，鄰近小菌核聚結和產生色素[3-6]。本研究表明，與核盤菌、齊整小核菌等多種植物病原真菌相似，氧化應激也誘導粗柄羊肚菌菌核的發生，暗示羊肚菌菌核發育的生理學機制與其他真菌相似，可借鑒其研究成果。進一步測定不同生理狀態菌株的TRS分子成分、凋亡或壞死相關的小片段DNA以及主要ROS成分、超氧化物自由基的變化，有助于深入理解羊肚菌菌核發育的生理學機制。采用比較轉錄組學技術結合基因功能分析，深入研究羊肚菌菌核發育的分子機制，將會有效地促進羊肚菌人工栽培馴化的發展。

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