靈芝三萜類化合物對AD大鼠腦海馬神經細胞Aβ1-40的影響

張玥 羅俊 黃能慧 張小毅

(貴州醫科大學藥理學教研室，貴州 貴陽 550004)

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靈芝三萜類化合物對AD大鼠腦海馬神經細胞Aβ1-40的影響

張玥 羅俊△黃能慧 張小毅

(貴州醫科大學藥理學教研室，貴州 貴陽 550004)

目的 研究靈芝三萜類化合物(GLT)對阿爾茨海默病(AD)大鼠腦海馬神經細胞Aβ1-40表達的影響。方法 將自然衰老模型大鼠60只隨機均分為六組：模型組，GLT低、中、高劑量組，溶媒對照組(食用油)及陽性對照組(健腦膠囊)，5個月齡大鼠10只為正常對照組。連續灌胃給藥60 d后，免疫組化法檢測海馬Aβ1-40表達。結果 模型組海馬神經細胞Aβ1-40表達增多，GLT組Aβ1-40表達減少。結論 GLT有防治AD的作用，其作用機制可能與減輕Aβ的神經毒性以及減少腦內Aβ沉積有關。

靈芝三萜類化合物； 阿爾茨海默病； 自然衰老； β-淀粉樣肽

阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)是一種神經系統退行性疾病，已成為僅次于心血管疾病、腫瘤、腦卒中的第4位死因。AD起病潛隱，主要表現為嚴重的認知和記憶功能減退等[1]。AD病因不明，缺乏有效的防治手段。除了使用腦細胞代謝激活劑和其他一些藥物外，對該病的中藥治療也開始研究[2]。本課題組曾在國內首次應用靈芝主要有效成分GLT(ganoderma Lucidum triterpenoids)進行防治AD的研究。本文擬觀察GLT對AD模型大鼠腦海馬神經細胞Aβ1-40(β-Amyloid1-40)表達的影響，以深入探討其防治AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑及實驗動物 GLT(中科院地化所提取)，健腦膠囊(JNJN，青島國風藥業公司)，ANTI-β-Amyloid(1-40)(武漢 BOSTER公司)，BIOMIAS-99圖像分析系統(四川大學圖像圖形研究所)。SD大鼠由貴州醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 動物分組及方法 取24月齡大鼠100只，5月齡大鼠10只，進行Morris水迷宮實驗，以后者逃避潛伏期均數+2倍標準差為標準，24月齡大鼠大于該值的為AD大鼠[3]。篩選出的60只AD大鼠隨機分為六組，每組10只，雌雄各半。1次/d灌胃給藥，連續60 d。模型組(NS 10 mL/kg)、溶媒對照組(食用油 10 mL/kg)、GLT低、中、高劑量組(0.25g/kg、0.5 g/kg、1.0 g/kg)及陽性對照組(JNJN 0.38 g/kg)。5月齡大鼠為正常對照組(NS 10 mL/kg)。

給藥結束后迅速于冰臺上0 ℃下斷頭取出大腦。取視交叉后5 mm厚的冠狀位腦片(包含海馬)，石蠟包埋，連續冠狀切片，用于分析海馬神經細胞Aβ1-40的表達水平(按試劑盒操作)。用BIOMIAS-99圖像分析系統進行分析。每張切片隨機選取5個視野(400倍)，每個視野選取5個陽性表達區域，測量平均灰度值(mean gradation，MG)，以5個視野MG平均值代表其陽性表達率。

2 結 果

模型組大鼠的海馬神經元胞漿呈深染棕黃色顆粒狀改變，經圖像分析測定，模型組MG(81.82±3.80)及溶媒組MG(84.71±4.52)較正常對照組MG(190.56±4.68)顯著降低(P<0.01)，提示Aβ1-40的表達增多，神經毒性增強；與模型組比較，GLT低、中、高劑量組大鼠海馬神經元胞漿呈淺染棕黃色顆粒狀改變，GLT低、中、高劑量組及陽性對照組MG較模型組顯著增高(P<0.01)，分別為(124.74±4.31)、(149.97±5.73)、(177.57±5.91)、(88.11±4.48)，提示Aβ1-40的表達減少，神經毒性減弱，見圖1。

圖1 GLT對自然衰老模型大鼠海馬Aβ1-40表達的影響 (×400)

3 討 論

AD的發病機制據研究可能與腦內Aβ沉積、膽堿能傳遞功能紊亂、自由基損傷等因素有關。AD是氧化應激誘導的蛋白質代謝紊亂，Aβ是負面效應的核心分子。習慣所稱靈芝屬中赤芝的子實體部分。靈芝具有廣泛的藥理活性，主要有效成分之一是GLT[4-6]，本文旨在觀察GLT對AD大鼠腦神經細胞Aβ1-40的影響，研究該藥對AD有無防治功能，并探討其可能的作用機制。

AD的病理學改變有老年斑、神經元纖維纏結、大量神經元丟失及顆粒空泡變性等，聚集的Aβ具有神經毒性作用，Aβ沉積是AD的主要發病因素[7]。建立理想的模型是研究的重要環節，而本研究采用自然衰老認知障礙模型，更符合衰老因素在AD發病過程中的重要作用[8]，在組織病理學以及神經生物化學變化方面模擬出與AD相似的特征。本研究結果表明：與正常對照組相比，自然衰老模型大鼠海馬神經元胞漿呈深染棕黃色顆粒狀改變，Aβ1-40表達明顯增多，神經毒性增強。Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)及前體類似物等經蛋白酶分解后的產物，APP是存在于細胞表面的跨膜糖蛋白，廣泛存在于各種組織中，但只有在神經元中，APP才易裂解產生Aβ。正常代謝情況下APP被α分泌酶水解，生成可溶性分泌型APP(sAPPα)，sAPPα可以保護神經元免受興奮性毒素和氧化反應損傷；異常情況下，β分泌酶裂解APP產生一個sAPPβ片段，剩下的羧基端肽段在γ分泌酶作用下產生Aβ(80%～90%的Aβ1-40和10%～20%的Aβ1-42)。產生的Aβ，其1/3左右的序列位于APP的跨膜結構域，由于其跨膜區的疏水性，使Aβ易于聚集沉積導致SP出現[9]。予GLT灌胃兩個月后，與模型組比較，GLT低、中、高劑量組及陽性藥組大鼠海馬神經元胞漿呈淺染棕黃色顆粒狀改變，Aβ1-40表達減少，神經毒性減弱，提示GLT有一定程度的對抗Aβ神經損傷的作用。本文結果表明GLT有防治AD的作用，其作用機制可能與減輕Aβ的神經毒性以及減少腦內Aβ沉積有關。

[1] 吳文寶,孔慶宏,闞祥緒，等.凋亡通路及caspases在阿爾茨海默病中作為治療靶點的研究[J].中國藥理學通報，2015,31(11):1496-1501.

[2] 陳琴.老年癡呆的發病機制與藥物治療概況[J].貴州醫藥，2012，36(4):361-364.

[3] 盛樹力.老年性癡呆：從分子生物學到臨床診治 [M].北京：科學技術文獻出版社，1998：351-352.

[4] 陳慧，楊海龍，劉高強. 靈芝三萜的生物合成和發酵調控[J].菌物學報，2015, 34(1): 1-9.

[5] 李欽艷，陳逸湘，鐘瑩瑩. 靈芝主要活性成分及其功能的研究進展[J].食藥用菌，2015，23(2):86-91.

[6] 林志彬.中西醫結合研究詮釋靈芝的扶正固本功效[J].福建中醫藥大學學報,2010,20(6):1-6.

[7] 樊有忠，趙珊珊.吡格列酮對Aβ25-35所致癡呆大鼠的學習記憶能力及海馬內氧化應激的影響[J].貴州醫藥，2016，40(2):119-121.

[8] 趙保勝，徐暾海．老年性癡呆疾病模型的建立[J]．中國實驗方劑學雜志，2011，7(6):274．

[9] Chang Y，Xue YL. Progress of Alzheimer disease's pathogenesis [J]. Chin J Clin Rehab， 2004, 8(4) : 693-695.

Effects of the expression of Aβ1-40in Alzheimer disease of the model animals through Ganoderma Lucidum Triterpenoids

ZhangYue,LuoJun,HuangNenghui，ZhangXiaoyi.

DepartmentofPharmachology,GuiyangMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China

Objective To observe the effects of the expression of Aβ1-40in Alzheimer Disease (AD) of model animals by used the Ganoderma Lucidum Triterpenoids (GLT).Methods 60 natural aging rats were randomly divided into 6 groups which were GLT low dose group, GLT middle dose group, GLT high dose group, model group, solvent group (oil), and positive group (JNJN). Then the intragastric administration was used. After being treated with GLT for 60 days, the expression of Aβ1-40in hippocampus was tested by immunohistochemistry.Results The expression of Aβ1-40in hippocampus increased in model rats, while GLT group significantly decreased. Conclusion GLT can protect AD model animals, and the following mechanisms may be decreasing the deposition of Aβ.

Ganoderma Lucidum Triterpenoids; Alzheimer disease; Natural aging; β-Amyloid

教育部科學技術研究重點項目(V200801);貴州省科技攻關項目(黔科合2004NGY031);貴州省優秀科技教育人才省長專項資金(2005293)

R285.5

A

1000-744X(2016)07-0681-02

2016-04-25)

△通信作者