MicroRNA-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞生物學特性的作用研究

秦忠宗 鄧一帆 祝剛 晏廣

(惠州市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 惠州 516001)

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MicroRNA-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞生物學特性的作用研究

秦忠宗 鄧一帆 祝剛 晏廣

(惠州市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東 惠州 516001)

目的 觀察膠質(zhì)母細胞瘤干細胞表達miR-203后對其生物學特性的影響。方法 采用免疫磁珠分選出CD133+腫瘤干細胞，對其轉染并表達miR-203，免疫熒光染色檢測CD133等，實時定量RT-PCR檢測巢蛋白(nestin)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和微管相關蛋白2(MAP2)表達以鑒定其多向分化能力，成球?qū)嶒炘u價其自我更新能力；最后采用CCK-8和流式凋亡分別檢測miR-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞增殖和凋亡的影響。結果 培養(yǎng)并分選出的CD133+膠質(zhì)母細胞瘤干細胞表達CD133和nestin標記物，且分化后表達星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP和神經(jīng)元標志物MAP2，且CD133+細胞miR-203表達明顯低于CD133-細胞(P<0.05)；miR-203轉染兩個7 d后CD133+腫瘤干細胞的一、二次成球數(shù)目均顯著低于對照組細胞的成球數(shù)(P<0.05)；進一步實時定量RT-PCR檢測示miR-203轉染4 d后細胞CD133和nestin的mRNA和蛋白表達均明顯降低，而GFAP和MAP2的mRNA和蛋白表達均升高(P<0.05)；miR-203轉染24，48，72，96和120 h后細胞存活率均明顯低于對照組細胞(P<0.05)；進一步流式檢測示miR-203細胞的凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。結論 miR-203可能成為膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的分子治療靶點。

膠質(zhì)母細胞瘤； 干細胞； miR-203； 靶向治療

膠質(zhì)母細胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中生存預后較差的惡性腫瘤，治療后患者的生存期僅約為1年[1]。目前的研究[2]證明腫瘤干細胞在膠質(zhì)母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展和治療抵抗中可能發(fā)揮了重要作用。MicroRNA是一條23 nt的非編碼單鏈RNA，可與其靶向mRNA的3’末端非編碼區(qū)(3’UTR)互補配對以下調(diào)基因表達，且已證明[3]其與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系。miR-203在多種腫瘤中表達降低，其可能是一種抑癌miRNA[4-6],再者，膠質(zhì)瘤患者中的miR-203低表達提示了預后不良。本研究旨在探討miR-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞自我更新、多向分化能力、增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 原代培養(yǎng) 收集膠質(zhì)母細胞瘤患者的腫瘤組織于無菌離心管中，內(nèi)含Neurobasal干細胞培養(yǎng)基(1∶50 B27 vitaminA添加劑、20 μg/L重組人堿性成纖維細胞生長因子、20 μg/L重組人表皮生長因子EGF、10 μg/L重組人白血病抑制因子、4 μ/L肝素和1∶100雙抗青霉素/鏈霉素)，去除壞死組織液及血液，剪成0.5 mm3并加入0.1%胰蛋白酶，37 ℃消化20 min，吹打至單細胞懸液，過濾后1 000 rpm離心5 min，加入紅細胞裂解液處理3 min，離心收集細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)。

1.2 分選CD133+干細胞并純度測定 觀察到懸浮細胞球達直徑150～200 μm時用免疫磁珠細胞分選試劑盒及分選器，嚴格按照說明書行CD133的陽性細胞分選。收集細胞，按200 μL/108細胞加入免疫磁珠細胞分選液，吹打至單細胞懸液，同時按100 μL/108細胞加入與微磁珠結合的CD133抗體，4 ℃中結合30 min，并按1 mL/108細胞加入分選液清洗細胞，離心后棄上清收集細胞且按500 μL/108細胞加入分選液重懸；將結合作用后的細胞懸液加入分離柱中，加入2 mL分選液抽提，以沖洗出CD133陽性細胞。分選出的CD133陽性和陰性細胞分別加入50 μL CD133/2(293C3)-PE抗體或50 μL同型對照mIgG2b-PE抗體，流式細胞分析儀進行檢測，以進行純度測定。

1.3 分子鑒定 免疫熒光染色檢測分選后細胞CD133、nestin的表達，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基誘導干細胞分化，檢測分化后細胞星形膠質(zhì)細胞標志物神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)元的標志物微管相關蛋白2(MAP2)的表達。

1.4 miR-203轉染 人成熟miR-203與其對照的無意義寡核苷酸鏈(NC)嚴格按照使用說明轉染CD133+干細胞。將帶有紅色熒光標記的miR-203和NC分別轉染膠質(zhì)母細胞瘤干細胞，并在轉染48 h后熒光顯微鏡下行細胞計數(shù)，并統(tǒng)計細胞轉染效率。轉染后48 h，RT-PCR檢測兩組細胞的miR-203的表達。

1.5 成球?qū)嶒?在轉染miR-203和NC后，吹打至單細胞懸液并以1 000個/孔的細胞密度于96孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中7 d后，對每個孔進行細胞計數(shù)以記錄形成的一次成球數(shù)目。再收集每個孔的細胞球，輕柔反復吹打至單細胞懸液，再次轉染且計數(shù)，同樣按1 000個/孔的細胞密度于96孔板中再培養(yǎng)7 d后，計數(shù)每個孔形成的二次成球數(shù)目。

1.6 轉染后mRNA表達 轉染miR-203和NC 4 d后，抽提細胞總RNA。逆轉錄反應為：27 ℃，9 min；37 ℃，120 min；85 ℃，5 min；最后降至4 ℃，cDNA保存于-80 ℃冰箱。使用熒光染料法進行mRNA的定量測定，嚴格按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒的說明書進行。熒光定量PCR擴增反應為：93 ℃，4 min預變性；93 ℃，20 s；60 ℃，30 s；70 ℃，30 sec；共循環(huán)40次。

1.7 細胞增殖實驗及凋亡實驗 收集分選鑒定后的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞，以10 000個細胞/孔細胞計數(shù)，分別轉染miR-203和無意義寡核苷酸鏈NC，在轉染后的24，48，72，96，120 h，采用CCK-8試劑盒進行細胞增殖活性的測定，并采用流式細胞分析儀進行轉染miR-203和NC 3 d后細胞調(diào)亡實驗檢測，Cell Quest分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結 果

2.1 膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的培養(yǎng)、分選與鑒定 將收集的原代細胞置于干細胞培養(yǎng)基中約3～5 d后可見形成懸浮細胞球，并經(jīng)免疫磁珠法分選得CD133+細胞，將細胞置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)約3～5 d后形成神經(jīng)干細胞樣的細胞球(膠質(zhì)母細胞瘤球)，7～9 d后膠質(zhì)母細胞瘤球呈圓形或卵圓形，邊緣清楚光滑，折光性較好。免疫熒光染色示膠質(zhì)母細胞瘤干細胞廣泛表達CD133和Nestin兩種干細胞標記物(圖1A～B)，誘導干細胞分化后細胞表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP和神經(jīng)元標志物MAP2(圖1C～D)。

2.2 miR-203在膠質(zhì)母細胞瘤干細胞中的表達 RT-PCR檢測示CD133-細胞中miR-203的表達較CD133+細胞顯著性增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對CD133+干細胞轉染48 h后，在熒光顯微鏡下細胞計數(shù)，并統(tǒng)計紅色熒光陽性細胞，得到miR-203組細胞的轉染效率為(72.11±15.83)%；RT-PCR檢測示轉染miR-203組細胞的miR-203表達為NC組的(74.21±10.76)倍(n=3，P<0.05)。

2.3 miR-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞自我更新能力的影響 CD133+細胞轉染7 d后miR-203組細胞球形成數(shù)量較少，體積也較小，按NC組細胞球數(shù)目為100%計算，一次成球miR-203組細胞球數(shù)目為(52.34±15.19)%，差異具有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05)，二次成球miR-203組細胞球數(shù)目為(30.15 ± 9.27)%，差異具有統(tǒng)計學意義(n=3，P<0.05)。

2.4 miR-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞多向分化能力的影響 CD133+細胞轉染后4 d，定量RT-PCR檢測轉染后miR-203和NC兩組細胞的CD133、nestin、GFAP、MAP2的mRNA表達情況，與NC組比較，miR-203組細胞的CD133和nestin的mRNA表達明顯降低，GFAP和MAP2的mRNA表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 miR-203對膠質(zhì)母細胞瘤干細胞增殖和凋亡的影響 與NC組比較，CD133+細胞轉染miR-203組不同時間點的細胞存活率均顯著性降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。其中最小的細胞生存率出現(xiàn)在轉染后72 h。與NC組(4.10±0.28)%比較，流式細胞儀檢測示轉染miR-203組的細胞凋亡率(11.87±1.66)%明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

3 討 論

本研究首先從人膠質(zhì)母細胞瘤的原位腫瘤組織中分離、培養(yǎng)、分選和鑒定得到了CD133陽性的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞，且可形成膠質(zhì)母細胞瘤球，并可表達干細胞標記物CD133和nestin，也可誘導分化表達GFAP和MAP；再者，在CD133陽性膠質(zhì)母細胞瘤干細胞中， miR-203均呈低表達狀態(tài)，這提示了miR-203的低表達可能是膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的分子特征之一。某些miRNA的特異性表達可能代表著膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的不同起源，不同的miRNAs表達譜也就代表著膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的特有表型[7]。在進一步的功能實驗中發(fā)現(xiàn)miR-203可以逆向調(diào)節(jié)著膠質(zhì)母細胞瘤干細胞的特性，轉染miR-203后干細胞的自我更新能力受限，再有miR-203促進干細胞分化為星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，并且可以抑制增殖和促進凋亡。研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-203在U251膠質(zhì)母細胞瘤細胞株中可以直接靶向作用于PLD2發(fā)揮其抑癌作用。目前PLD2基因的生物學作用逐漸被揭示，在HeLa細胞中發(fā)現(xiàn)PLD2增高可以激活ERK和p38 MAPK信號通路，且可以提高抗凋亡基因Bcl-2的表達以發(fā)揮其促癌作用。再者，PLD2在星形膠質(zhì)細胞瘤中可以通過激活活性氧和p38 MAPK通路提高COX-2的表達發(fā)揮作用。

注：A.CD133+膠質(zhì)母細胞瘤干細胞(免疫熒光染色，×400)；B.Nestin陽性的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞(免疫熒光染色，×400)；C.GFAP陽性的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞(免疫熒光染色，×400)；D：MAP2陽性的膠質(zhì)母細胞瘤干細胞(免疫熒光染色，×400)。圖1 膠質(zhì)母細胞瘤干細胞熒光顯微鏡下形態(tài)學表現(xiàn)

基于ARIMA模型的貴陽市云巖區(qū)手足口病預測分析

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