負性共刺激分子免疫球蛋白BTLA的特點及其在肺結核病灶組織中的表達

程曉菊 周國旗

(遵義市第一人民醫院，貴州 遵義 563000)

負性共刺激分子免疫球蛋白BTLA的特點及其在肺結核病灶組織中的表達

程曉菊 周國旗

(遵義市第一人民醫院，貴州 遵義 563000)

目的 探討不同年齡段肺結核患者病灶組織中負性共刺激分子BTLA的表達情況。方法 設立老年肺結核組(15例)、青年肺結核組(13例)、對照組(10例)，分別利用免疫組織化學染色檢測各組肺組織中BTLA表達，同時常規進行血清炎癥指標PCT、IL-6檢測、結核抗體檢測及γ-干擾素釋放實驗。結果 13例青年肺結核患者中有7例檢測出血清結核抗體，陽性率為54%；15例老年肺結核患者中有5例檢測出血清結核抗體，陽性率為33%；對照組中有1例檢測出血清結核抗體，陽性率為10%。兩個年齡組肺結核患者炎癥指標PCT、IL-6水平較對照組增高(P<0.05)，而兩年齡組肺結核患者之間炎癥指標PCT水平無明顯差異(P>0.05)。兩個年齡組肺結核患者肺組織中BTLA表達較對照組明顯增高(P<0.05)，并且青年肺結核患者肺組織中BTLA表達量高于老年肺結核患者(P<0.05)。13例青年肺結核患者中有12例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為92%；15例老年肺結核患者中有10例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為67%；對照組中有2例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為20%。結論 負性共刺激分子BTLA可能參與了不同年齡段肺結核的免疫調節，其可能成為肺結核研究的新靶點。

肺結核； B、T淋巴細胞衰減子； 免疫組化

我國是肺結核的高發地區，隨著老年化進程的不斷加劇，防控任務變得更加嚴峻。老年肺結核患者因受臨床癥狀不明顯，檢查結果不確切，治療依從性差等因素的影響，該人群診治面臨很大的困難。既往的研究已經充分證實免疫病理損傷是肺結核發病的重要發病機制[1]，機體免疫功能衰退可能是老年肺結核患者臨床表現不同于青年患者的原因之一[2]。所以，充分研究老年肺結核患者的免疫學調節機制可能為該病的防治奠定理論基礎。B、T淋巴細胞衰減子(BTLA)是新近發現的腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員，其與配體HVEM結合后產生免疫抑制效應[3]。近來的研究發現BTLA可能參與了肺結核的免疫調節[4]，但未得到完全闡明，因此，進一步研究BTLA在肺結核患者機體中的表達可能為肺結核提供新的治療靶點。本文擬通過檢測不同年齡段肺結核患者病灶組織中BTLA的表達和分析臨床資料與之相關性探討BTLA表達對肺結核發病機制的影響。

1 資料與方法

1.1 納入對象 收集遵義市第一人民醫院呼吸內科2014年1月至2015年1月住院的老年肺結核患者15例，其中男性7例，女性8例，平均年齡(71.4±7.6)歲，所有患者均排除糖尿病、腫瘤、肥胖和系統性炎癥疾病；同期住院的青年肺結核患者13例，其中男性9例，女性4例，平均年齡(26.1±2.5)歲；對照組10例，其中男性5例，女性5例，平均年齡(41.8±9.3)歲，系胸外傷肺葉切除患者，無吸煙史，無心臟病或其他基礎疾病病史。

1.2 方法 (1)血清炎癥指標PCT、IL-6及結核抗體檢測：所有納入對象空腹抽取靜脈血2 mL，置于無菌常規管中，凝固后于常溫3 000 r/min離心5 min，留取血清于-20 ℃保存待查。PCT、IL-6檢測采用免疫發光法定量檢測試劑盒測定，正常參考值分別為<0.046 ng/mL、<7 pg/mL；結核抗體檢測采用膠體金法，正常參考值陰性。(2)γ-干擾素釋放實驗：①樣品采集與制備：用肝素鋰抗凝采血管采集待檢者外周血，將血液與預熱至室溫的RPMI1640不完全培養液按照體積比1∶1混合均勻；按照混勻血樣與淋巴細胞分離液的體積比為2～3∶1的比例，離心后收集中間的白色細胞層，即PBMC。洗滌后將細胞重懸于2 mLAIM培養液中，計數，調整細胞濃度為2.5×106個/mL。②檢測：按實驗室方法規范操作。③結果的判定：當陰性對照孔斑點數為0～5，若TB刺激物孔比陰性孔紫色斑點數≥5個，則判為陽性，反之，判為陰性；當陰性孔紫色斑點數≥6個時，若TB刺激物孔是陰性孔紫色斑點數的2倍，則判為陽性，反之，判為陰性。(3)免疫組織化學染色：免疫組織化學染色采用PV二步法檢測盒(中杉金橋生物有限公司，中國)，根據說明書操作：3～5 μm組織切片常規脫蠟至水,1% H2O2處理后高壓修復2 min，然后按1∶150濃度稀釋鼠抗人BTLA單克隆(Origene，美國)一抗4 ℃孵育過夜，充分PBS沖洗后滴加二抗37℃孵育，最后DAB顯色和蘇木精復染。圖像分析：利用計算機圖像分析軟件IPWin32采集系統，每張切片隨機采集5個不同視野；根據文獻[5]的評分標準HIS=A×B(注：A為陽性細胞數分級,0%～1%=0,2%～10%=1,11%～50%=2,51%～80%=3,81%～100%=4；B為陽性細胞顯色強度分級，0為陰性，1為弱陽，2為陽性，3為強陽性)進行免疫組織化學染色評分，半定量分析BTLA蛋白表達量。

1.3 統計學處理 檢測結果數據用均數±標準差表示，組間差異用t檢驗。用SPSS 22.0統計軟件分析。

2 結 果

13例青年肺結核患者中有7例檢測出血清結核抗體，陽性率為54%；15例老年肺結核患者中有5例檢測出血清結核抗體，陽性率為33%；對照組中有1例檢測出血清結核抗體，陽性率為10%。兩個年齡組肺結核患者炎癥指標PCT、IL-6水平較對照組增高(P<0.05)，而兩個年齡組肺結核患者之間炎癥指標PCT、IL-6水平無明顯差異(P>0.05)。兩個年齡組肺結核患者肺組織中BTLA表達較對照組明顯增高(P<0.05)，且青年肺結核患者肺組織中BTLA表達量高于老年肺結核患者(P<0.05)。13例青年肺結核患者中有12例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為92%；15例老年肺結核患者中有10例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為67%；對照組中有2例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為20%。見表1。

表1 各組檢查結果比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與老年肺結核組比較，#P< 0.05。

3 討 論

肺結核是嚴重威脅人類健康的常見傳染性疾病，在中低收入國家肺結核的患病人數占全球患病總人數的95%以上[6]。我國是結核病的高發區，每年有很大數量的肺結核新發病例出現及因該病所致死亡和喪失勞動力者；加上人類免疫缺陷病毒的蔓延，耐藥菌株的不斷出現，人口結構和生活環境的改變，給肺結核的防控帶來極大挑戰，形勢十分嚴峻[7]。雖然衛生行政部門通過健康體檢等方式加大了對肺結核易患人群的監控，但是作為特殊人群的老年患者往往因衛生和居住條件的限制而使監控變得非常困難；同時，老年肺結核患者有癥狀不典型、檢查結果變異性大，治療效果不確切等特點，這使臨床診治面臨很大困難，容易導致疾病的誤診。因此，明確不同年齡段肺結核患者免疫反應狀態可能為該疾病的診治提供新的線索。

目前感染性疾病常用的炎癥標記物有血清PCT和IL-6水平的檢測，肺結核作為一種特異性炎癥反應，低水平PCT和IL-6已被臨床應用于肺結核與社區獲得性肺炎的鑒別診斷[8]。本組結果顯示兩個年齡組肺結核患者炎癥指標PCT、IL-6水平較對照組增高，而兩個年齡組肺結核患者之間炎癥指標PCT、IL-6水平無明顯差異。因此，血清炎癥標記物PCT和IL-6水平的檢測也可以作為老年肺結核患者鑒別診斷的重要指標。

眾所周知，肺結核的診斷主要根據病原學依據和典型的病理學特點進行確診，近年來一些新的實驗室檢查有助于提高肺結核的診斷率，如血清結核抗體檢測和γ-干擾素釋放實驗[9]。本資料結果顯示，13例青年肺結核患者中有7例檢測出血清結核抗體，陽性率為54%，15例老年肺結核患者中有5例檢測出血清結核抗體，陽性率為33%，對照組中有1例檢測出血清結核抗體，陽性率為10%；同時，13例青年肺結核患者中有12例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為92%，15例老年肺結核患者中有10例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為67%，對照組中有2例γ-干擾素釋放實驗陽性，陽性率為20%。雖然血清結核抗體檢測和γ-干擾素釋放實驗提高了肺結核的診斷率，但我國是結核病高發地區，肺結核隱形感染的人數較多以至以上兩項結果出現假陽性率明顯增加，因此，如果單純使用血清結核抗體檢測或γ-干擾素釋放實驗作為肺結核的診斷指標可能增加誤診率的發生。

BTLA是一種免疫球蛋白相關性膜蛋白，其作為HVEM的配體之一能與HVEM結合后活化抑制性信號通路。既往的研究已經證實BTLA主要表達在各種類型的免疫細胞，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和自然殺傷細胞[10]。大量的動物實驗結果表明BTLA發揮抑制效應，但這些實驗主要集中在研究免疫相關性疾病上，如病毒性肝炎等。近來的研究表明BTLA可能與感染性疾病的發生與發展有關， 比如Steinberg等[11]的研究證實BTLA在腸道炎癥的預防方面起到重要的作用，同時Zeng等的研究表明BTLA在αβ T細胞上的表達與機體對抗結核桿菌感染有關。本組資料結果顯示，兩個年齡組肺結核患者肺組織中BTLA表達較對照組明顯增高，且青年肺結核患者肺組織中BTLA表達量高于老年肺結核患者。由此，我們推測BTLA可能參與了結核分枝桿菌對肺組織的免疫損傷過程，并且不同年齡段肺結核患者肺組織BTLA的表達可能存在差異，BTLA的表達可能間接地反映機體的免疫狀態，深入研究負性共刺激分子BTLA在肺結核的免疫機制可能為肺結核的研究提供一條新的思路。

[1] 蘇瑾文，程小星. 重癥肺結核的免疫病理研究進展[J]. 中華臨床醫師雜志(電子版)，2013，7(24):11783-11787.

[2] 李文君. 老年性肺結核臨床特點及預后分析[J]. 現代診斷與治療， 2012，23(5)：495.

[3] Carreno BM, Collins M. BTLA: a new inhibitory receptor with a B7-like ligand[J]. Trends Immunol， 2003，24:524-527.

[4] Zeng JC, Lin DZ, Yi LL,et al. BTLA exhibits immune memory for αβ T cells in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. Am J Transl Res, 2014, 6(5):494-506.

[5] Soslow RA, Dannenberg AJ, Rush D, et al. Cox-2 is expressed in human pulmonary, colonic, and mammary tumors[J]. Cancer,2000,89:2637-2645.

[6] World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2013. Geneva, Switzerland: World Health Organization; 2013.

[7] 王黎霞，成詩明，陳明亭，等. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[J]. 中國防癆雜志, 2012，34(8)：485-508.

[8] Niu WY, Wan YG, Li MY,et al. The diagnostic value of serum procalcitonin, IL-10 and C-reactive protein in community acquired pneumonia and tuberculosis[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2013, 17(24):3329-3333.

[9] 王紡. 酶聯免疫斑點試驗與結核抗體平行檢測菌陰性結核比較[D].吉林大學，2013.

[10] Murphy TL, Murphy KM. Slow down and survive: Enigmatic immunoregulation by BTLA and HVEM[J]. Annu Rev Immunol, 2010,28:389-411.

[11] Steinberg MW, Turovskaya O, Shaikh RB,et al.A crucial role for HVEM and BTLA in preventing intestinal inflammation[J]. J Exp Med, 2008, 205(6):1463-1476.

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