熒光原位雜交技術及染色體核型分析在產前診斷中的應用

鄭慧玲 鄭琳 朱曉西 楊雪 吳忠琴

(貴陽市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，貴州 貴陽 550003)

·技術與方法·

熒光原位雜交技術及染色體核型分析在產前診斷中的應用

鄭慧玲 鄭琳 朱曉西 楊雪 吳忠琴

(貴陽市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，貴州 貴陽 550003)

目的 探討熒光原位雜交技術(FISH)及染色體核型分析技術在產前診斷中的應用價值。方法 應用FISH技術對未培養(yǎng)的羊水間期細胞進行13、16、18、21、X/Y號染色體數(shù)目檢測，同時對培養(yǎng)后的羊水中期細胞進行染色體核型分析。結果 600例羊水標本FISH檢測均得出結果，檢測成功率為100%，F(xiàn)ISH檢測出31例陽性結果，異常核型檢出率為5.2%。600例羊水標本染色體核型分析中598例檢測出結果，2例標本污染無法分析，檢測成功率為99.7%。598例檢測結果中陽性結果63例，異常核型檢出率為10.5%。結論 FISH檢測羊水胎兒染色體非整倍體的方法過程簡便、快速，成功率高，結論可靠。但只能檢出特定染色體的非整倍體，應用有一定的局限性。與傳統(tǒng)染色體核型分析技術相互聯(lián)合、補充，可以更好地應用于產前診斷中。

熒光原位雜交； 核型分析； 染色體異常； 產前診斷

在目前的醫(yī)療條件下，染色體病尚無有效的治療方法，染色體異常在新生兒的發(fā)病率為0.1%～0.2%，最常見的是21-三體綜合征，其次為Turner綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征及Klinefelter綜合征等。產前診斷是防止具有嚴重遺傳病、智力障礙及先天畸形患兒出生的有效措施。目前對胎兒染色體疾病的產前診斷多采用孕中期行羊膜腔穿刺羊水細胞培養(yǎng)，對染色體中期分裂相進行核型分析，操作時間長且技術復雜。現(xiàn)熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)作為一種成熟技術在國內外臨床中得到廣泛地應用，它利用已知堿基序列作為探針，以非放射性熒光物質標記后對待測核酸進行定性、定位及相對定量分析[1]，這項技術的應用大大地提高了診斷效率，縮短了診斷時間。我們同時采用羊水間期細胞的FISH檢測及中期細胞染色體核型分析對我院600例羊水標本進行檢測，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年2月至2014年5月在我院優(yōu)生遺傳門診需進行產前診斷的孕婦600例，年齡19～44歲，孕周16～25周。產前診斷指征包括高齡孕婦185例、血清學篩查高危255例、B超異常9例、不良孕產史42例、多項指征(符合前面兩項及兩項以上)76例以及其他33例。所有孕婦均簽署行FISH檢測及核型分析知情同意書。在B超引導下經(jīng)腹抽取羊水20～30 mL，置于三個無菌試管中待檢。一管用于FISH檢測，兩管用于細胞培養(yǎng)進行核型分析。

1.2 主要試劑 選用英國Cytocell公司的CEP18/X/Y及LSI13/21探針。

1.3 實驗方法 (1)羊水間期細胞的處理：一管羊水標本離心→低滲30 min→固定→滴片→56 ℃老化2 h→0.05 g/L胃蛋白酶消化17 min→PBS漂洗→后固定→PBS漂洗→70%、90%、100%冰乙醇梯度脫水各3 min，晾干。(2)雜交：加探針至相應玻片上，封片，變性3 min后37℃雜交2 h→洗脫→暗處風干→復染。(3)閱片：熒光顯微鏡下觀察，每例計數(shù)50～100個細胞，鏡下觀察若>60%的核顯示非整倍體信號則該樣本判斷為非整倍體；若5%～60%的核顯示非整倍體信號則提示該樣本有可能為嵌合體，在中期細胞核型分析時應加大計數(shù)。(4)染色體核型分析：兩管羊水離心去上清，取沉淀物0.5 mL加入4.5 mL羊水細胞培養(yǎng)基混勻加入培養(yǎng)瓶中，至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，一周后每天觀察，收獲并制片，G顯帶后進行核型分析，計數(shù)30個中期細胞，并分析4個核型。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。不同產前診斷指征檢測數(shù)據(jù)采用卡方檢驗統(tǒng)計處理。

2 結 果

2.1 間期羊水細胞FISH檢測結果 600例標本FISH檢測全部成功，檢測成功率為100%，報告時間為1～3 d。結果顯示：31例陽性結果，包括19例21-三體、6例18-三體、2例45,XO、1例47,XXY、1例48,XXX,+18及2例嵌合體,陽性結果檢出率為5.2%,569例陰性結果。見表1。

2.2 培養(yǎng)中期細胞染色體核型分析結果 600例標本中，598例培養(yǎng)成功，成功率為99.7%，報告時間為10～20 d;2例未培養(yǎng)成功標本FISH檢測正常，孕婦拒絕再次檢測，胎兒分娩后隨訪新生兒健康。培養(yǎng)成功標本全部進行了染色體核型分析，結果顯示：63例陽性結果，陽性檢出率為10.5%。其中數(shù)目異常30例，孕婦知情選擇引產；結構異常15例，2例孕婦知情選擇引產；多態(tài)變異18例。結構異常和多態(tài)異變的33例中，31例均遺傳自父源或母源，孕婦選擇繼續(xù)妊娠。其余535例未發(fā)現(xiàn)染色體明顯異常。見表1。

表1 FISH檢測陽性結果與染色體核型分析陽性結果對比

2.3 FISH檢測出的染色體異常與產前診斷指征的相關性 600例標本中，42.5%的孕婦因血清學篩查高危而行產前診斷，F(xiàn)ISH檢測出5.88%的陽性結果；30.8%的孕婦因高齡行產前診斷，共檢出2.2%的陽性結果；1.5%的孕婦因B超異常而行產前診斷，檢出22.2%的陽性結果；12.7%的孕婦因多項指征而行產前診斷，檢出13.2%的陽性結果；而12.7%的孕婦因不良孕產史或其他原因而行產前診斷，未檢出陽性結果。見表2。

表2 不同產前診斷指征檢測結果比較

注：與B超異常相比，aP<0.01；與多項指征相比，bP<0.01。

3 討 論

產前診斷是降低新生兒出生缺陷的有效途徑之一。傳統(tǒng)的染色體核型分析技術作為產前診斷的金標準一直備受重視，但由于其操作技術要求高，報告時間長，對染色體嵌合現(xiàn)象難于解釋等弊端，已成為產前診斷發(fā)展的瓶頸。自從1986年Gremer等[2]將FISH技術應用于間期細胞核檢測染色體非整倍體異常，其以成功率高、簡便、快速檢測的優(yōu)勢架起了細胞遺傳學與分子遺傳學的橋梁，開辟了間期細胞遺傳學研究，為快速產前診斷提供了有效的應用平臺。

新生兒最常見的染色體異常是21、13、18號染色體的三體和X染色體單體及其他性染色體的非整倍體[3]，據(jù)統(tǒng)計，這些異常在臨床上占染色體異常的80%以上。本資料中，33例結構異常和多態(tài)變異標本中，31例均來自父源或母源，B超隨檢未發(fā)現(xiàn)異常繼續(xù)妊娠 ，生產后新生兒隨訪健康，其余2例中1例21-三體、1例18號染色體部分缺失引產。以發(fā)病風險計算，F(xiàn)ISH檢測陰性結果的發(fā)病風險為0.35%，也就是說，F(xiàn)ISH檢測陰性，99.6%的胎兒都是正常的，這與其他學者[4-5]的研究結果相符。

目前，B超引導進行羊膜腔穿刺獲得羊水是我國產前診斷的主要方法之一，本資料600例病例均進行產后跟蹤隨訪，除32例染色體異常選擇引產及1例穿刺45 d后流產外，其余孕婦無因穿刺操作引起的感染、流產、胎兒損傷等并發(fā)癥，隨訪新生兒健康。雖然現(xiàn)已有非創(chuàng)傷性方法以獲得胎兒DNA，但羊水細胞核型分析仍然是產前診斷的金標準。

本實驗對600例標本同時進行了FISH檢測和染色體核型分析，單就13、18、21、性染色體非整倍體的檢測來說，核型分析檢測到的30例陽性標本在FISH檢測中均能檢測到；另外，結構異常標本中有1例核型為[46,XX,der(14;21)(q10;q10),+21]，F(xiàn)ISH也檢測到21號染色體有三個信號，這足以證明FISH的敏感性、特異性與核型分析結果一致，與國內外其他學者的研究相符[6]。2例嵌合體標本FISH也有檢測到，其中核型為47,XX,+21[7]/46,XX[93]的標本FISH檢測提示21號染色體信號為2個的占92%，信號為3個的占8%。國外有學者認為未培養(yǎng)羊水細胞比培養(yǎng)細胞有可能更好地反映染色體嵌合現(xiàn)象[7]。然而由于FISH檢測有可能會出現(xiàn)非特異性信號，對于提示有嵌合體存在的標本我們要結合核型分析結果進行診斷結果的咨詢。FISH檢測由于自身的局限性使得其不能像核型分析一樣檢測到染色體的結構異常，也不能檢測到除13、18、21、性染色體以外的其他19對染色體的數(shù)目異常，因此本資料中有14例染色體結構異常和18例染色體多態(tài)FISH無法檢測出來。這提示我們，F(xiàn)ISH作為快速產前診斷非整倍體的檢測平臺，有較大的臨床應用價值，但不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的核型分析方法，將兩者取長補短、相互補充，在提高檢測成功率的同時提高檢測效率才能為臨床遺傳咨詢提供完整準確的實驗室依據(jù)。

[1] 孫筱放,黎青,黃艷秋,等.熒光原位雜交技術在細胞遺傳學中的應用[J].現(xiàn)代婦產科進展,1996，5(4)：318.

[2] Gremer T , Lundegen J.Detection of chromosom eaberration in the human in terfuse nucleus by visualizat ion of special target DNAs with radioactive and nonradioactive in situ hybridizationt echniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L184[J]. Hum Genet,1986,74:346-352.

[3] Schubert R,Raff R, Schwanitz G. Molecular-cytogenetic investigations of ten term placentae in cases of prenatally diagnosed mosaicism[J]. Prenat Diagn, 1996, 16:907-913.

[4] Eiben B, Trawicki W, Hammans W, et al. A prospective comparative study on fluorescence in situ hybridization (FISH) of uncultured amniocytes and standard karyotype analysis[J].Prenat Diagn,1998,18(9):901-906.

[5] Cheong Leung W, Chitayat D, Seaward G，et al. Role of amniotic fluid interphase fluorescence insitu hybridization (FISH) analysis in patient management[J]. Prenat Diagn, 2001, 21(4): 327-332.

[6] Shaffer LG, Bui TH. Molecular cytogenetic and rapid aneuploidy detection methods in prenatal diagnosis[J]. Am J Med Genet C Semin Med Genet,2007,145C:87-98.

[7] Van Opstal D, Van den Berg C, Galjaard RJ, et al. Follow-up investigations in uncultured amniotic fluid cells after uncertain cytogenetic results[J]. Prenat Diagn, 2001,21:75-80.

R714.5

B

1000-744X(2016)08-0861-03

2016-01-25)