加味丹參飲含藥血清對hVEGF165轉染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影響

楊洋，黃政德，阮甦，梁暉，嚴年文，林昱，高千仞

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州350004；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410007）

加味丹參飲含藥血清對hVEGF165轉染BMSCs促IRI大鼠心肌血管新生的影響

楊洋1，黃政德2，阮甦1，梁暉1，嚴年文1，林昱1，高千仞1

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州350004；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410007）

目的探討加味丹參飲含藥血清誘導血管內皮生長因子165（hVEGF165）轉染后BMSCs移植IRI大鼠的心肌血管新生的影響。方法構建hVEGF165轉染BMSCs，將hVEGF165轉染后PIII／IV BMSCs分別加入加味丹參飲含藥血清和空白血清，體外誘導48 h。建立IRI大鼠模型，將實驗大鼠分為4組，A組：假手術組；B組：IRI組；C組：hVEGF165轉染組；D組：hVEGF165轉染+加味丹參飲含藥血清組。移植第7天，HE染色觀察心肌組織形態學變化并做微血管計數。結果移植7 d后，與A組相比，B組心肌微血管有一定再生，C組及D組與B組相比，微血管數上升明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）；D組與C組相比，微血管數上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論IRI大鼠模型在移植hVEGF165轉染BMSCs后，新生血管增多，加味丹參飲含藥血清和hVEGF165轉染聯合應用效果更佳。

加味丹參飲；骨髓間充質干細胞；hVEGF165；基因轉染；心肌缺血再灌損傷；血管新生

骨髓間充質干細胞（BMSCs）有取材方便、可來源于自身、免疫原性較低、在體外增殖能力強、并不涉及倫理學問題的特點，目前已作為一種重要的種子細胞，引起研究人員的廣泛關注［1］。BMSCs可以在適當的誘導條件下分化為心肌細胞、血管內皮細胞、神經細胞、上皮細胞和脂肪細胞以及骨骼、骨髓基質、肌腱、關節和肌肉等多種組織［2］，成為目前心血管領域的研究熱點。

大量實驗研究證明：中藥對干細胞的增值、定向分化有調控作用［3］。在黃芪、丹參等中藥對BMSCs的分化影響研究中發現：黃芪、丹參含藥血清對BMSCs的增殖具有促進作用［4］。有研究表明黃芪甲苷具有誘導BMSCs分化為心肌樣細胞的作用［5］。本實驗在前期研究［6］基礎上，以hVEGF165基因轉染BMSCs為切入點，建立大鼠心肌IRI模型，通過加味丹參飲含藥血清體外誘導hVEGF165基因轉染后BMSCs移植大鼠心肌IRI模型，觀察移植后第7天大鼠心肌血管新生的影響。

1 材料

1.1 實驗動物及移植細胞SPF級SD大鼠，雌雄各半，平均體質量在（220±20）g，平均周齡12～14周，共80只，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證：SCXK（湘）2009-0004，實驗過程符合動物倫理學要求［7］。移植用hVEGF165轉染BMSCs：將攜有血管內皮生長因子165基因的質粒pGLVEF1a，采用慢病毒轉染BMSCs。

1.2 加味丹參飲灌胃液制備本方是黃政德教授運用“行氣活血”之法治療胸痹心痛的有效經驗方，由丹參、赤芍、檀香、川芎、當歸等組成，草藥由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房提供。除檀香外，其它藥材加雙蒸水3 000 mL浸泡30 min，回流提取2 h，濾出藥液；再加雙蒸水2 L，回流提取90 min；檀香分兩等份分別于兩次提取結束前15 min加入；合并兩次藥液，水浴濃縮至500 mL，3 500 rpm，離心10 min，取上清液；繼續濃縮至生藥濃度為1 g/mL，共250 mL，4℃條件下保存備用。

1.3 主要儀器AIR TECH超凈臺（蘇州凈化集團有限公司）；AX-ⅡX射線攝影暗室（廣東粵華醫療器械廠有限公司）；倒置熒光顯微鏡（奧林巴斯株式會社）；切片機（湖北泰康醫療設備有限公司）；大鼠心電圖機（江蘇玉研科儀器有限公司）；小動物呼吸機（江蘇玉研科儀器有限公司）。

1.4 溶液配制含藥血清制備：SD大鼠平均體質量（270±10）g，雌雄各半，平均周齡12～14周，共30只。參照《藥理實驗方法學》［8］，按照動物與人體的每公斤體重劑量折算系數表，成人與大鼠折算系數為6.25。按60 kg成人每天服用加味丹參飲60 g計算，大鼠臨床等效計量為60 g/60 kg×6.25＝6.25 g/kg。加味丹參飲灌胃液，按照6.25 g/kg，2次/d，連續5 d對SD大鼠進行灌胃。腹主動脈取血，3 000 rpm，10 min離心后吸出上部血清，得到加味丹參飲含藥血清，于-20℃冰箱中保存備用。空白血清制備：等數量SD大鼠灌胃等劑量生理鹽水，2次/d，連續5 d。制備及保存方法同含藥血清。

2 方法

2.1 心肌缺血再灌注損傷模型建立符合要求SD大鼠，10%水合氯醛麻醉固定，接心電圖，剪去左側胸部3～6肋區域和頸部毛，碘伏消毒鋪單；剪刀剪開頸部皮膚，鈍性分離肌肉組織，暴露氣管，行氣管插管術，接呼吸機；剪刀剪開左側胸部皮膚，手術刀片于四五肋間沿肋間隙切開肌肉，開胸器開胸暴露心臟，鈍性分離心包，暴露心臟，在左冠狀動脈前降支伴行靜脈旁進針2 mm，將靜脈及伴行左冠狀動脈前降支共同結扎。造模成功標志：左冠狀動脈前降支供血區心肌蒼白，心臟搏動減弱，心電圖顯示肢體導聯R波振幅明顯升高，I導聯和aVL導聯J點明顯抬高。結扎15 min后松線，造成IRI模型。

2.2 III/IV代hVEGF165轉染BMSCs制備及動物分組采用全骨髓貼壁法，雌雄各半，平均體質量（50±10）g，平均周齡3～4周，共20只SD大鼠。處死后無菌條件下取出脛骨和股骨，暴露骨髓腔，L-DMEM液反復沖洗骨髓腔。沖洗液，1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，加入含有15%胎牛血清的完全培養液，制成單細胞懸液按1×108個/mL密度接種于50 cm2培養瓶中，在37℃、飽和濕度、5%的CO2培養箱中培養，當細胞生長融合基本達到80%～90%時進行傳代。取生長融合70%～80%的III/IV代hVEGF165轉染BMSCs備用。造模成功SD大鼠隨機分組，每組10只（死亡大鼠剔除，手術組均予結扎30 min后實施干預），A組：假手術組，只穿線，不結扎；B組：IRI組；C組：在IRI模型成功后，進行hVEGF165轉染BMSCs移植；D組：在IRI模型成功后，進行加味丹參飲含藥血清誘導的hVEGF165轉染BMSCs移植。

2.3 加味丹參飲含藥血清最佳工作濃度采用前期研究得出促進BMSCs分泌VEGF最佳濃度的40%加味丹參飲含藥血清為本實驗的工作濃度［9］，取hVEGF165轉染PIII/IV代BMSCs，體外誘導48 h后，收集細胞，調整細胞密度，進行細胞移植。

2.4 移植及給藥方法

2.4.1 注射位置的確定造模后，缺血心肌蒼白搏動減弱，與正常心肌細胞的鮮紅色形成對比，此處為心肌梗死的邊緣，實驗中細胞移植注射位置。

2.4.2 注射方法A組：造模成功，在確定心肌梗死邊緣后，皮試用注射器將EP管內細胞懸濁液吹打1～2次，使細胞懸濁液充分混勻，抽取100 μL hVEGF165基因轉染BMSCs細胞溶液；將注射器針尖部平壓于心臟外壁，待局部跳動減弱后，刺入心肌，注入約1/3細胞溶液。同樣方法選擇另外兩注射點將細胞溶液注入心肌中。移植后關閉胸腔，在大鼠恢復自主呼吸后拔除氣管插管，撤呼吸機，縫合頸部皮膚；碘伏消毒創面，予青霉素預防感染，送回單籠飼養。B組：于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL的L-DMEM。C組：于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL的空白血清干預后hVEGF165轉染BMSCs（細胞密度3×106）。D組：于梗死區邊緣心肌組織的3個位點直接注入共100 μL的加味丹參飲含藥血清誘導后hVEGF165轉染BMSCs（細胞密度3×106）。

2.5 檢測指標及方法大鼠IRI造模前后記錄心電圖，HE染色觀察心肌變化及微血管計數。

2.6 統計學處理應用SPSS16.0軟件對數據進行統計學分析。計量資料符合正態分布用x±s表示，采用單因素方差分析。

3 結果3.1IRI

大鼠心電圖的改變結扎左冠狀動脈后，Ⅱ導聯見ST段抬高明顯，T波高聳；缺血再灌注后，出現病理性Q波；隨著時間延長，ST段下移，病理性Q波持續存在。見圖1。

3.2 心肌組織形態學改變的觀察

3.2.1 肉眼觀察心肌形態變化結扎時，可見結扎供血區心肌出現灰白色缺血灶，局部組織可有輕度水腫，再灌注后缺血的心肌轉變為紅色。7 d后D組結扎部位供血區心肌與正常心肌顏色接近。

3.2.2 光鏡下各組7 d時心肌組織形態學變化A組：心肌細胞形態正常，纖維排列整齊有序，肌橫紋清晰規則，染色均勻。B組：缺血心肌纖維壞死，纖維瘢痕組織出現于心肌間質，光鏡下可見細胞核溶解，缺血邊緣見少量血管新生。C組：缺血心肌細胞改變不如B組明顯，新生微血管較B組多。D組：缺血心肌細胞改變不如B組及C組明顯，新生微血管較B組及C組增多。見圖2。

3.3 光鏡下4組7 d時心肌微血管計數見表1。

表1 4組光鏡下微血管計數比較

表1 4組光鏡下微血管計數比較

注：與B組比較，1）P＜0.05；與C組比較，2）P＜0.05。

組別A組B組C組D組微血管計數/個13.6±2.2 15.3±1.7 18.0±1.81）22.5±2.51）2）

4 討論

胸痹心痛多發于中老年人，其特點為患者年齡漸高，臟腑功能隨之衰退，陽氣不足，氣不行血，心脈瘀阻；或憂思過度，肝失疏泄，氣滯則血行不暢，心脈閉阻。加味丹參飲由丹參、赤芍、檀香、川芎、當歸、紅花、生地黃等組成，本方重用丹參為君以活血祛瘀，輔以赤芍、川芎、當歸、紅花加強活血化瘀并兼養血行氣，佐以檀香行氣止痛。

現代藥理研究表明：丹參能夠增加冠狀動脈血流量，改善微循環，促進側支循環的開放，調節血液在心肌重新分布，從而保護缺血心肌［10］。赤芍中赤芍總苷可改善心肌缺血缺氧狀態，從而達到保護心肌的作用［11］。阿魏酸是川芎和當歸有效成分，可改善血液循環，從而防止缺血對心肌的進一步損傷［12］。

本實驗中采用了成熟的造模方法，運用細胞轉染技術研究加味丹參飲對IRI大鼠心肌血管新生的影響。在前期研究中，課題組得出了加味丹參飲含藥血清誘導BMSCs移植對心肌IRI模型大鼠梗死心肌邊緣區血管新生具有明顯的促進作用［13］。本實驗以hVEGF165基因轉染BMSCs為切入點，觀察了細胞移植后第7天心肌微血管再生情況，實驗結果顯示：細胞移植組和加味丹參飲體外誘導的細胞移植組，與IRI組相比，均可促進心肌微血管再生，且加味丹參飲＋hVEGF165基因轉染BMSCs移植組中微血管新生數量較其他組高。這種作用有可能是在hVEGF165基因轉染BMSCs后，促進BMSCs血管內皮生長因子分泌，誘導BMSCs分化為血管內皮細胞，進一步促進心肌血管新生的作用有關。

［1］鄒兵，謝軍平，吳清華，等.Livin基因修飾的骨髓間充質干細胞移植治療對急性心肌梗死大鼠心功能影響［J］.中國病理生理雜志.2016，32（3）：539-543.

［2］LIU H J，HU R Y，DAI W J，et al.Culture and identification of bone marrow mesenchymal stem cells from enhanced green fluorescent protein-transgenic rats［J］.Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2016，38（1）：9-15.

［3］石景洋，唐學敏.中藥對間充質干細胞培養分化及干細胞移植治療心腦血管疾病的影響［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（49）：2983-2986.

［4］蔡建平，張愛國，許寶滿，等.五種中藥（或方劑）含藥血清對體外骨髓間充質干細胞增殖活性影響的篩選研究［J］.時珍國醫國藥，2011，22（6）：1385-1387.

［5］冼紹祥，楊忠奇，秦佳佳，等.5-氮胞苷誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化及黃芪甲苷的協同作用［J］.中國組織工程研究，2012，16（10）：1861-1865.

［6］楊洋，黃政德，田雪飛.血管內皮生長因子165轉染骨髓間充質干細胞綠色熒光蛋白的表達［J］.中國組織工程研究雜志，2013，17（36）：6381-6387.

［7］中華人民共和國科學技術部.關于善待實驗動物的指導性意見［R］.2006-09-30.

［8］魏偉，吳希美，李元建.藥理實驗方法學［M］.4版.北京：人民衛生出版社，2010.

［9］楊洋.加味丹參飲含藥血清對hVEGF165轉染BMSCs移植IRI大鼠心肌血管新生的研究［D］.長沙：湖南中醫藥大學，2013.

［10］馬丙祥，董寵凱.丹參的藥理作用研究新進展［J］.中藥房，2014，24（4）：663-665.

［11］陸小華，馬驍，王建，等.赤芍的化學成分及藥理作用研究進展［J］.中草藥，2015，46（4）：595-602.

［12］周鴻，黃含含，張靜澤.川芎-當歸藥對研究進展［J］.中成藥，2015，37（1）：184-188.

［13］趙鴻.加味丹參飲含藥血清體外誘導的BMSCs移植對心肌IRI模型大鼠血管新生影響的研究［D］.長沙：湖南中醫藥大學，2012.

R285.6

：A

：1000-338X（2016）06-0040-03

2016-09-18

國家自然科學基金資助（30973750）

楊洋（1983—），男，醫學博士。研究方向：中西醫結合內科臨床研究。

黃政德（1955—），男，博士，教授，博士生導師。E-mail：Hzd112 @136.com