紅景天苷對腦缺血再灌注大鼠炎性細胞因子表達的影響

魏藝聰，洪海棉，應雄，陳建雄，張小琴，洪桂祝

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

紅景天苷對腦缺血再灌注大鼠炎性細胞因子表達的影響

魏藝聰，洪海棉，應雄，陳建雄，張小琴，洪桂祝

（福建中醫藥大學藥學院，福建福州350122）

目的從炎癥反應探討紅景天苷減輕腦缺血再灌注繼發損傷的早期保護機制。方法健康成年雄性SD大鼠36只，隨機分為假手術組、模型對照組、紅景天苷給藥組3組。通過線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，采用Longa評分法對大鼠神經功能損傷評分，給藥24 h后取材，RT-qPCR技術檢測大鼠患側腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等炎癥因子的mRNA表達，Western blot法檢測大鼠患側腦組織iNOS與COX-2蛋白的表達。結果與模型對照組比較，紅景天苷給藥組能明顯降低患側腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等炎癥因子的mRNA表達（P＜0.01），同時降低iNOS與COX-2蛋白的表達（P＜0.05）。結論紅景天苷能夠降低腦缺血再灌注模型大鼠患側腦組織的炎癥反應，并抑制iNOS／NO及COX-2／PGE2炎癥信號通路有關。

紅景天苷；腦缺血再灌注；炎性細胞因子；iNOS／NO；COX-2／PGE2；信號通路

腦缺血再灌注（MCAO）后引起的炎癥反應在腦組織損傷過程中起重要作用，大量研究表明：腦缺血再灌注后釋放大量炎癥信號，促進炎性細胞的聚集和炎性因子的釋放，引起腦組織水腫、血腦屏障破壞等，從而加重腦組織的損傷［1］，因此，炎癥反應被認為是腦缺血再灌注后腦組織繼發性損傷的主要機制之一。有研究表明：iNOS/NO及COX-2/ PGE2信號通路參與TNF-α、IL-6、IL-1β等多種炎癥基因的調控，在腦卒中引發的炎癥反應中發揮重要作用，并進一步加重神經損傷［2-4］。

紅景天苷對羥基苯乙基-β-D葡萄糖苷，是紅景天的主要活性成分［5］。紅景天是生長于海拔3 500 m以上的天然植物，在我國具有悠久的藥用歷史。根據《中華人民共和國藥典》（2015版），紅景天的功能與主治為“益氣活血，通脈平喘，用于氣虛血瘀，胸痹心痛，中風偏癱，倦怠氣喘”。報道顯示其減少疲勞、提高精神等功效被西方國家包括瑞典、法國和德國等國家認可，紅景天苷具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等功能［5］。我們曾報道：動物造模后連續6 d紅景天苷給藥后可顯著減少大鼠局灶性腦缺血再灌注大腦的梗死體積和降低腦缺血大鼠神經功能缺損評分，具有顯著神經保護作用，而其早期的神經保護作用機制尚不清楚［6-7］。為進一步闡明紅景天苷減輕繼發性損傷的早期神經保護作用機制，本研究從炎癥反應和iNOS/NO及COX-2/PGE2信號通路研究了紅景天苷減輕腦缺血再灌注繼發損傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物健康成年雄性SPF級SD大鼠36只，體質量（280±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司（合格證號：2007000509960，許可證號：SCXK（滬）2007-0005），飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室。

1.2 主要試劑與受試藥物總RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，批號：74106）；反轉錄試劑盒RT試劑盒（美國Fermentas公司，批號：K1622）；熒光定量PCR Master Mix（美國Applied Biosystems公司，批號：R110 22），PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，TNF-α基因引物：上游序列5'-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3'；下游序列5'-GCTACGGGC TTGTCACTCG-3'，PCR擴增片段長度為149 bp。IL-6基因引物：上游序列5'-AGACTTCACAGAGGA TACCACCCAC-3'；下游序列5'-CAATCAGAATTGC CATTGCACAA-3'，PCR擴增片段長度為129 bp。IL-1β基因引物：上游序列5'-ACAAGGAGAGACA AGCAACGACAA-3'；下游序列5'-TTTCCATCTTCT TCTTTGGGTATTG-3'，PCR擴增片段長度為149 bp。MCP-1基因引物：上游序列5'-CAGGTGTCCCAAAGAAGCTGTAGTA-3'；下游序列5'-AGGTGCT GAAGTCCTTAG GGTTGAT-3'，PCR擴增片段長度為172 bp。MCP-5基因引物：上游序列5'-ACCAGATTCAGTGTTCACCCCAGT-3'；下游序列5'-GCT GCTTGTGATTTTCCT GTAGCTC-3'，PCR擴增片段長度為100 bp。MIP-1α基因引物：上游序列5'-GCAGACAGTGGCAGGGATT-3'；下游序列5'-CACCCTTTAGCATCTTTTGGAC-3'，PCR擴增片段長度為173 bp。MIP-2基因引物：上游序列5'-CAATGCCTGACGACCCTACC-3'；下游序列5'-TTG-GACGATCCTCTGAACC-3'，PCR擴增片段長度為100 bp。GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAA CCCATCACCA-3'；下游序列5'-ACGCCA GTAGAC TC-CACGACAT-3'，PCR擴增片段長度為96 bp。紅景天苷由福建中醫藥大學生物醫藥研發中心提供，純度為99%；iNOS多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-651）、COX2多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：sc-23984）、β-actin抗體（碧云天生物技術有限公司，批號：H015）。

2 實驗方法

2.1 腦缺血再灌注動物模型制作大鼠術前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%的水合氯醛（300 mg·kg-1）麻醉，仰臥位固定，將尼龍單絲線栓從左頸總動脈插入到大腦中動脈的起始端，栓塞后2 h，將線栓拔出致血液再灌注，假手術組動物不栓塞中腦動脈。造模過程中，連續監測動物的溫度，并保持溫度在37℃。根據Longa［8］評定法對造模動物進行神經功能損傷程度評價，評級達3～4為模型動物，可用于實驗。

2.2 分組與給藥應用隨機對照試驗方法將36只大鼠分為假手術組、模型對照組和紅景天苷給藥組各12只。紅景天苷給藥組在造模成功后，立即腹腔注射紅景天苷（50 mg·kg-1），其余2組腹腔注射同容積的生理鹽水。24 h后，3組動物斷頭取腦組織，用于分析。

2.3 神經功能損傷評價根據Longa評定法［8］，0級：無缺陷；1級：不能伸展對側前肢；2級：對側前肢屈曲；3級：輕度向對側轉圈；4級：嚴重的轉圈；5級：對側癱瘓。

2.4 TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2檢測按照QIAGEN RNeasyMini Kit試劑盒提取總RNA，用Fermentas的RT逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，建立qPCR體系為20 μL，反應條件為50℃2 min，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，退火58℃15 s，聚合72℃20 s 40個循環。以GAPDH為內參，以2-ΔΔCt法計算各組間mRNA的表達量。

2.5 Western blot檢測大鼠患側腦組織iNOS與COX-2的蛋白表達提取總蛋白，總蛋白經SDSPAGE垂直板全濕法電泳法分離后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，用封閉液封閉2 h后加入稀釋的一抗（iNOS多克隆抗體1∶800，COX-2多克隆抗體1∶500，β-actin單克隆抗體1∶3 000），4℃下孵育過夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀釋HRP標記的第二抗體，室溫下孵育2 h后，TBS洗3遍，每次10 min。之后加ECL顯色劑經凝膠成像分析系統檢測，分析目標條帶的灰度值，以目標蛋白與β-actin的灰度值比值作為目標蛋白的相對量，并統計各組之間的差異。

2.6 統計學處理用SPSS 18.0統計軟件進行分析，數據以x±s表示，各組數據間的差別用ANOVA方法分析。

3 結果

3.13 組患側腦組織TNF-α、IL-6與IL-1β等炎癥細胞因子mRNA表達比較見圖1。

3.23 組患側腦組織MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化細胞因子mRNA表達比較見圖2。

3.33 組患側腦組織iNOS與COX-2蛋白表達比較見圖3和圖4。

4 討論

缺血性腦卒中由于局部區域血流不足，引起興奮性毒性，氧化應激，鈣超載等一系列早期事件，從而激活膠質細胞分泌TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎性細胞因子，MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化因子等炎癥介質，導致血液來源的炎性細胞，包括中性粒細胞、T細胞、單核細胞/巨噬細胞等，滲透到腦缺血區域，浸潤的白細胞進一步釋放這些細胞因子和趨化因子，引起神經膠質細胞的進一步活化，從而產生炎癥信號級聯擴大反應，釋放各種細胞毒性成分，破壞血腦屏障，進一步加重免疫損傷和神經元死亡等晚期事件。總之，TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等炎癥介質對腦卒中后炎性損傷具有重要作用［1-4］。因此，有效抑制腦卒中后TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎性細胞因子，MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化因子等炎癥介質的表達，有助于抑制腦卒中后炎性損傷。我們的研究結果表明，腦缺血后紅景天苷具有抑制TNF-α、IL-6與IL-1β等促炎性細胞因子及MCP-1、MCP-5、MIP-1α與MIP-2等趨化因子表達的抗炎作用。

iNOS和COX-2與腦卒中炎性損傷關系密切。在腦缺氧/缺血，誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在浸潤巨噬細胞和活化的小膠質表達增加，導致缺血性損傷［2-4］，此外，PGE2是與炎癥有關的重要介質。COX-2是PGE2生物合成的限速酶，這在大腦中的局部缺血后損傷中起關鍵作用。我們的研究結果表明，腦缺血后紅景天苷的抗炎作用與iNOS和COX-2表達的抑制有關。

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R285.6

：A

：1000-338X（2016）06-0046-03

2016-09-12

福建省衛生廳課題（WZZY201305）

魏藝聰（1981—），講師，碩士，研究方向：中藥藥理研究。

洪桂祝（1966—），女，教授。E-mail：guizhuhong@yahoo. co.uk