灰樹花多糖協同順鉑對HeLa細胞凋亡的影響

解嘉志 王文碩 許巖松 邱 原 金海萍 呂冬霞

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

灰樹花多糖協同順鉑對HeLa細胞凋亡的影響

解嘉志 王文碩 許巖松 邱 原 金海萍 呂冬霞

(佳木斯大學，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討灰樹花多糖(PGF)協同順鉑(DDP)對HeLa細胞凋亡的作用。方法 流式細胞儀測定不同藥物處理組的凋亡率,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細胞形態,免疫組化法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 蛋白表達。結果 流式細胞儀檢測顯示：PGF(0.05 mg/L)、DDP(1 mg/L)及聯合組(PGF 0.05 mg/L+ DDP 1 mg/L)作用24 h凋亡率分別為21.28%、23.60%和42.13%，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，協同作用組與各單藥組比較差異顯著(P<0.05)；HE染色觀察到凋亡細胞形態學改變；免疫組化顯示，聯合用藥組與兩單藥組比較caspase-3 蛋白表達上調。結論 聯合用藥對HeLa細胞的凋亡率較單獨用藥組有明顯提高，其作用機制可能與caspase-3蛋白表達上調有關。

灰樹花多糖；順鉑；細胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

化療藥物在惡性腫瘤的治療中起到非常重要的作用，但毒副作用也較大。研究表明，灰樹花多糖(PGF)具有改善免疫系統功能、抑制腫瘤、調節血糖等功能〔1〕。本研究選用PGF聯合順鉑(DDP)，研究其對HeLa細胞凋亡的影響，探討PGF對DDP的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料 小牛血清與RPMI1640培養液(杭州四季青),DDP(山東齊魯制藥)，PGF(浙江方格藥業公司)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 免疫組化試劑盒(天津索羅門生物公司)。超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，流氏細胞儀(美國BD公司)。HeLa細胞(武漢大學典型培養物冷藏中心)。

1.2 細胞培養與分組 使用RPMI1640完全培養液(含10%小牛血清)培養細胞。常規方法傳代。前期研究顯示0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP聯合作用于24 h時點具有協同作用。分組：空白對照組：予含10%小牛血清的RPMI1640培養液；PGF組：PGF濃度為0.05 mg/L；DDP組：DDP濃度1 mg/L;0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP為聯合用藥組。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細胞 多聚賴氨酸處理蓋玻片，將其置于6孔板中，以1×105個/ml接種，培養箱中培養24 h，加入藥液，于24 h進行常規HE染色，在顯微成像系統下觀察結果。

1.4 流式細胞儀測定凋亡率 取對數生長期細胞加入藥物，培養24 h后，采用磷脂結合蛋白Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。用無乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化、離心并收集細胞；冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次；400 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加5 μl Annexin V-FITC于懸液中，2℃～8℃避光15 min后，再加Propidium Iodide 5 μl，混勻繼續避光孵育5 min；1 h內進行流式細胞儀的觀察和檢測。

1.5 鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)免疫組化法檢測caspase-3 蛋白表達 根據說明書檢測caspase-3 蛋白表達。隨機選取不重復的10個高倍視野(×400)觀察 。鏡下caspase-3表達陽性細胞為細胞膜和細胞質呈褐色或棕黃色，計算陽性細胞數量，并求平均值。

1.6 統計學方法 應用SPSS11.5 軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 HE染色觀察凋亡細胞形態 倒置顯微鏡下觀察染色細胞，與對照組比較，處理組呈現典型的凋亡形態：胞體小，皺而圓，核深染，質濃縮。

2.2 流氏細胞儀測定凋亡率 PGF組、DDP組及聯合用藥組凋亡率分別為21.28%、23.60%和42.13%，與對照組(1.18%)比較均有顯著差異(P<0.05)；聯合用藥組與各單藥組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組化法檢測caspase-3 蛋白表達 聯合用藥組(49.94%±3.73%)與兩單藥組(DDP組：35.23%±3.69%；PGF組：33.61%±3.35%)比較caspase-3 蛋白表達上調(P<0.05,P<0.01)，且均高于空白對照組(10.11%±1.67%，P<0.05)。

3 討 論

本實驗通過HE染色觀察到典型的凋亡細胞。流式細胞儀檢測結果提示PGF與DDP有協同作用，使HeLa 細胞對DDP的敏感性提高。研究提示，PGF聯合DDP可明顯增強抗腫瘤作用，對其作用機制的研究為臨床PGF與DDP聯用并作為化療增敏劑治療宮頸癌提供了新思路、新方法。

目前研究普遍顯示，抗腫瘤藥物大多數以誘導腫瘤細胞凋亡的形式殺死腫瘤細胞進而達到治療目的〔2,3〕。引起細胞凋亡的因素很多，其中細胞凋亡是由一系列高度調控的caspase級聯反應導致的結果已被普遍接受，認為細胞凋亡的核心執行者是caspase〔4,5〕。caspase家族中caspase-3是效應caspase〔6〕。細胞間的信號傳遞被caspase-3通過下游效應因子切斷，并關閉DNA的復制與修復，破壞DNA的結構和細胞核，誘導凋亡小體的形成，進而執行凋亡功能〔7〕。

PGF、DDP單獨應用可導致細胞中caspase-3表達增強，且協同作用時caspase-3表達增強更為明顯。提示DDP與PGF促進細胞凋亡具有共同的途徑，這可能是二者在一定時間及一定劑量時產生協同作用的機制。

1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev,2001;6(1):48-60.

2 Wyllie AH,Kerr JF,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis〔J〕.Int Rev Cytol,1980;68(8):251-306.

3 Lee Y,Chong MJ,McKinnon PJ.Ataxia telangiectasia mutated-dependent apoptosis after genotoxic stress in the developing nervous system is determined by cellular differentiation status〔J〕.J Neurosci,2001;21(17):6687-93.

4 Rao RV,Hermel E,Castro-Obregon S,etal.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001;276(36):33869-74.

5 Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998;18(11):6353-64.

6 Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

7 Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci,1997;22(8):299-306.

〔2016-02-17修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

國家自然科學基金面上項目(No.31471312)；黑龍江省自然科學基金面上項目(No.H2015074)；黑龍江省大學生創新創業訓練計劃重點項目(No.2016102220234)；佳木斯大學大學生創新創業訓練計劃重點項目(No.2016102220234)

呂冬霞(1965-)，女，教授，碩士生導師，主要從事腫瘤發生機制與生物學治療研究。

解嘉志(1991-)，男，在讀本科，主要從事臨床醫學研究。

R730.52

A

1005-9202(2017)03-0531-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.004