TGF-β1通過F-actin聚合促進乳腺癌細胞MCF-7發生上皮-間質轉化

孫志亮，李洪利，尹崇高

(濰坊醫學院 1.生物科學與技術學院、2.醫學研究實驗中心、3.護理學院，山東 濰坊 261053)

TGF-β1通過F-actin聚合促進乳腺癌細胞MCF-7發生上皮-間質轉化

孫志亮1，李洪利2，尹崇高3

(濰坊醫學院 1.生物科學與技術學院、2.醫學研究實驗中心、3.護理學院，山東 濰坊 261053)

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮細胞失去極性，獲得間質形態的一個過程[1]。腫瘤細胞中，EMT的激活促進了腫瘤的侵襲轉移。轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 屬于TGF家族，它能夠調節細胞增殖、分化、細胞凋亡及細胞外基質的生成等[2]。在生理和病理狀態下，TGF-β1都是EMT發生的主要誘導因子之一。本文通過TGF-β1誘導乳腺癌細胞MCF-7，檢測細胞中EMT相關蛋白vimentin、E-cadherin的表達，F-actin的聚合情況以及LIMK、cofilin的磷酸化水平，進一步闡明TGF-β1促進乳腺癌細胞MCF-7 EMT的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 TGF-β1購自Peprotech公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、鼠抗人vimentin單克隆抗體均購自Santa Cruz；兔抗人p-LIMK單克隆抗體、兔抗人LIMK單克隆抗體、兔抗人p-cofilin單克隆抗體、 兔抗人cofilin單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology；鬼筆環肽購自eBioscience；胎牛血清和MEM培養液購自美國Hyclone公司；人乳腺癌細胞系MCF-7購自美國ATCC細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人乳腺癌細胞系MCF-7培養在含10%的胎牛血清、青鏈霉素的MEM培養基中，置于含5% CO2、37℃的培養箱中傳代培養。采用對數期細胞鋪到6孔板中，待其長到70%左右時棄去培養液，加入無血清的MEM培養基饑餓12 h后。將人乳腺癌細胞系MCF-7分組：A組細胞不加TGF-β1，作為陰性對照；B組細胞用TGF-β1進行誘導刺激。以時間梯度24、48、72 h進行誘導刺激。

1.2.2 Transwell侵襲實驗 按文獻[3]的步驟進行操作。在光學顯微鏡下隨機選取5個視野， 對穿到人工基膜底部的細胞進行觀察計數。每個實驗獨立重復3次，取平均數作為最終實驗結果。

1.2.3 F-actin聚合實驗 將A、B兩組細胞的懸濁液鋪在激光共聚焦培養皿中，培養72 h后，用4%的多聚甲醛固定。PBS清洗，加入1% 的BSA進行封閉。封閉20 min后，加入phalloidin(1 ∶50)于37℃孵育箱中孵育1 h。PBS清洗，隨后加入DAPI染核，染核20 min后，加入抗淬滅劑封片。

1.2.4 Western blot 細胞提取總蛋白，以等量蛋白上樣到12%的SDS-PAGE中進行電泳，電泳后蛋白分離并轉到PVDF膜上。用脫脂奶粉封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h。TBST洗膜后，加入化學發光劑ECL，X線膠片曝光。

2 結果

2.1 TGF-β1促進MCF-7細胞發生EMT Western blot 結果顯示，在用TGF-β1誘導的時間梯度24、48、72 h中，刺激時間在72 h發生EMT最為明顯。乳腺癌細胞MCF-7中E-cadherin蛋白水平下調，而vimentin蛋白水平上調(P<0.05)。

2.2 TGF-β1促進了乳腺癌細胞MCF-7的侵襲 Transwell侵襲結果顯示，用TGF-β1誘導72 h的MCF-7細胞，其穿到濾膜底部的細胞數明顯多于未用TGF-β1誘導的細胞數，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 TGF-β1誘導MCF-7細胞發生EMT后F-actin聚合作用的變化情況 免疫熒光檢測F-actin 聚合的變化結果顯示，在用TGF-β1誘導72 h后， TGF-β1誘導的乳腺癌細胞MCF-7中F-actin 的聚合作用比未誘導的乳腺癌細胞MCF-7明顯增加(P<0.05 )。

2.4 TGF-β1促進了MCF-7細胞中LIMK和cofilin的磷酸化 檢測了LIMK和cofilin的磷酸化水平。結果顯示，用TGF-β1誘導72 h后，LIMK和cofilin的磷酸化明顯增加 (P<0.05 )。

3 討論

肌動蛋白解聚因子絲切蛋白家系(ADF/cofilin)是一種肌動蛋白結合蛋白，它能夠切割F-actin，加快F-actin的解聚[4]。cofilin通過調節肌動蛋白骨架的重塑，對肌動蛋白相關細胞活動具有重要作用[5-6]。LIMK是cofilin的上游信號分子，通過磷酸化cofilin氨基端第3位絲氨酸(Ser-3)使得cofilin失去解聚肌動蛋白的能力，提高F-actin的穩定性。F-actin 的聚合與解聚合與腫瘤的侵襲轉移密切相關。研究發現，F-actin的解聚使得RhoA失活，促進EMT相關轉錄因子Snail和Smad1/2/3由細胞核向細胞質轉移，發生EMT的逆轉[7]。

本研究發現，TGF-β1在誘導MCF-7發生EMT的過程中p-LIMK、p-cofilin的表達明顯增強， F-actin的聚合明顯增加。E-cadherin蛋白水平下調，而vimentin蛋白水平上調。結果證實TGF-β1可以通過LIMK/cofilin信號通路影響F-actin的聚合，促使EMT的發生，闡述了TGF-β1促進EMT的發生機制，為抑制乳腺癌的侵襲轉移以及提高乳腺癌患者的生存率提供了理論依據。

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TGF-β1 promotes epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cell line MCF-7 through F-actin polymerization

SUN Zhi-liang1, LI Hong-li2, YIN Chong-gao3

(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology, 2.MedicineResearchCenter, 3.CollegeofNursing,WeifangMedicalUniversity,WeifangShandong261053,China)

TGF-β1；上皮-間質轉化；肌動蛋白絲聚合；LIM激酶；肌動蛋白解聚因子；乳腺癌

TGF-β1; EMT; F-actin polymerization; LIMK; cofilin; breast cancer

2017-01-22，

2017-02-27

國家自然科學基金青年基金項目(No 81402389)；山東省自然科學基金資助項目(No ZR2015HL065)；山東省高等學校科技計劃(No J12LK03，J13LK03)；國家級大學生創新訓練計劃項目(No 201510438011)；濰坊醫學院大學生科技創新基金資助項目(No KX2015012)

孫志亮(1995-)，男，學士，研究方向：腫瘤病理學，E-mail：szlwfmcswjs@163.com； 李洪利(1977-)，女，碩士，副教授，研究方向：腫瘤病理學，通訊作者，E-mail：ycglihongli@163.com

時間：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.056.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.028

A

1001-1978(2017)05-0735-02

R329.24；R341；R737.902.2；R977.6