雷公藤內(nèi)酯醇減少放射性肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞活化與抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相關(guān)

張彥偉，張志強(qiáng),2,3，吳麗賢,2,3，張魯榕，陳 純,2,3

(福建醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院藥理學(xué)系、2.新藥研究所、3.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；4.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 福建 福州 350004； 5.福建醫(yī)科大學(xué)放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350004)

雷公藤內(nèi)酯醇減少放射性肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞活化與抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相關(guān)

張彥偉1，張志強(qiáng)1,2,3，吳麗賢1,2,3，張魯榕4,5，陳 純1,2,3

(福建醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院藥理學(xué)系、2.新藥研究所、3.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122；4.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 福建 福州 350004； 5.福建醫(yī)科大學(xué)放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350004)

目的 通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)減少放射性肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞(MFBs)活化與TGF-β1/ERK/Smad3通路的相關(guān)性。方法 以TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞建立體外MFBs活化模型，C57BL/6小鼠胸部照射形成體內(nèi)MFBs活化、放射性肺纖維化模型。MFBs活化狀態(tài)通過(guò)檢測(cè)小鼠成纖維細(xì)胞中α-SMA(RT-PCR、Western blot方法)和Col Ⅰ(RT-PCR、ELISA方法)的表達(dá)，通路活性采用Western blot法檢測(cè)p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平。ERK siRNA及Smad3 siRNA觀察ERK、Smad3在MFBs活化中的地位。結(jié)果 TGF-β1激活p-ERK/p-Smad3(Ser208)及p-Smad3(Ser423)，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA，活化為MFBs，合成Col I明顯增多；使用ERK siRNA及Smad3 siRNA確定了ERK及Smad3均參與α-SMA、Col Ⅰ的表達(dá)，其中ERK可能通過(guò)磷酸化Smad3連接區(qū)(Ser208)起相關(guān)作用。小鼠胸部照射可致肺組織中p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)的水平上調(diào)，α-SMA表達(dá)增加，顯示多量MFBs活化。TPL對(duì)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中ERK、Smad3(Ser208)、Smad3(Ser423)的磷酸化活化均有明顯抑制作用，可明顯下調(diào)α-SMA表達(dá)及Col Ⅰ合成，減少M(fèi)FBs的活化。結(jié)論 TPL可通過(guò)抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路，減少肺部照射后MFBs活化，從而抑制放射性肺纖維化進(jìn)展。

雷公藤內(nèi)酯醇；放射性肺纖維化；肌成纖維細(xì)胞；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；Ⅰ型膠原蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；ERK；Smad3

放射性肺纖維化是胸部腫瘤放射治療常見(jiàn)而嚴(yán)重的并發(fā)癥，由于其發(fā)生率和嚴(yán)重度與照射劑量及照射范圍密切相關(guān)，因而成為限制胸部腫瘤(包括發(fā)病率高居全國(guó)乃至世界前位的肺癌、乳腺癌等)放射劑量的決定性因素，嚴(yán)重干擾腫瘤局部控制率及患者預(yù)后。目前，臨床對(duì)放射性肺纖維化尚無(wú)有效措施[1-2]。本研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide, TPL)能有效緩解實(shí)驗(yàn)性放射性肺纖維化，相應(yīng)劑量下無(wú)明顯不良反應(yīng)，具有良好的開(kāi)發(fā)前景[3]。 有關(guān)纖維化的機(jī)制研究顯示，肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts, MFBs)是纖維化病變的核心效應(yīng)細(xì)胞，在增生性疤痕及多種纖維化病變中，MFBs持續(xù)活化存在[4-5]。MFBs常由成纖維細(xì)胞活化或上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)，過(guò)量的、持續(xù)存在的MFBs通過(guò)分泌過(guò)量膠原蛋白[主要為Ⅰ型膠原蛋白(type Ⅰ collagen, Col Ⅰ)[6]]致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，通過(guò)表達(dá)MFBs標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等致組織過(guò)度收縮、順應(yīng)性下降，最終導(dǎo)致纖維化[4-5,7]。因此，MFBs已成為抗纖維化治療的重要靶標(biāo)。

我們的前期研究顯示，在放射性肺纖維化中，肺泡巨噬細(xì)胞通過(guò)分泌大量ROS、以旁分泌途徑刺激纖維細(xì)胞活化為MFBs，導(dǎo)致纖維化發(fā)生、發(fā)展；TPL通過(guò)抑制肺泡巨噬細(xì)胞、下調(diào)ROS、阻止MFBs的活化，從而減少基質(zhì)沉積、緩解纖維化[8]。

但誘導(dǎo)MFBs活化的途徑有多種，其中TGF-β1是常見(jiàn)的促M(fèi)FBs活化、促纖維化的重要因子[9]。在肺組織中，TGF-β1誘導(dǎo)α-SMA(即MFBs活化)主要由Smad3調(diào)控[10]。Hayashida等[11]的研究提出，Ras/MEK/ERK參與了對(duì)TGF-β1/Smad3通路的調(diào)節(jié)：TGF-β1與胞膜受體結(jié)合后，引起Ras/MEK/ERK的相繼激活, 活化的ERK繼而引起Smad3連接區(qū)絲/蘇氨酸的磷酸化(Ser 208/212)；另一方面，TGF-β1誘導(dǎo)Smad3 C端磷酸化(Ser 423/425，為Smad3入核的基礎(chǔ))，此多部位磷酸化的Smad3(Ser208/212, Ser423/425)與Smad4結(jié)合后入核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的能力增強(qiáng)[12]，促進(jìn)纖維細(xì)胞增生及膠原蛋白沉積[13]。但ERK是否通過(guò)磷酸化Smad3進(jìn)而參與調(diào)節(jié)α-SMA的表達(dá)，目前尚無(wú)相關(guān)研究。 在放射性肺纖維化發(fā)生過(guò)程中持續(xù)高表達(dá)TGF-β1，且TGF-β1水平可用于預(yù)測(cè)放療后發(fā)生肺纖維化的危險(xiǎn)性[14]，可見(jiàn)TGF-β1在放射性肺纖維化的發(fā)生中起重要作用，是促M(fèi)FBs活化的重要因素之一。TPL為多靶點(diǎn)作用藥物，且前期結(jié)果顯示TPL具有強(qiáng)效抗放射性肺纖維化作用，因此TPL對(duì)MFBs的抑制作用可能亦為多途徑。本實(shí)驗(yàn)觀察TPL對(duì)TGF-β1下游信號(hào)分子ERK、Smad3的影響，證實(shí)了TPL可通過(guò)抑制ERK、Smad3的磷酸化激活，減少M(fèi)FBs活化。

1 材料與方法

1.1 藥物 雷公藤內(nèi)酯醇(TPL)純品購(gòu)自上海柘智生物科技有限公司，純度>99%。TPL的配制：1 mg TPL加入1 mL DMSO充分溶解后，以注射用生理鹽水定容至10 mL，即配制成100 mg·L-1的濃縮液，分裝。用時(shí)以注射用生理鹽水稀釋至1 mg·L-1，微孔濾膜(0.22 μm)過(guò)濾除菌。

1.2 試劑 UltraCULTURETM無(wú)血清培養(yǎng)基(LONZA, USA)；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶(Gibco，USA)；胎牛血清(FBS，四季青生物工程技術(shù)研究所)；TGF-β1(R&D Systems，USA);Collagen Ⅰ ELISA 試劑盒(DuoSet ELISA kits，R&D Systems)；BIOZOL Total RNA Extraction Reagent(BioFlux，Germany)；BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒、BioEasy SYBR Green Ⅰ RT-PCR Kit(杭州博日科技)； 一抗anti-α-SMA、anti-phospho-ERK1/2、anti-ERK1/2(Abcam，USA)；anti-phospho-Smad3(Ser208)、anti-phospho-Smad3(Ser423)、anti-Smad3(Cell Signaling Technology, USA)；SignalSilence?p44/42 MAPK(ERK1/2) siRNA(Cell Signaling Technology)；si-m-Smad3(銳博生物科技有限公司)；X-tremeGene siRNA transfection reagent (Roche Diagnostics Corp., USA) ；青霉素-鏈霉素溶液(100×)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗、ECL試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) NIH3T3(小鼠成纖維細(xì)胞株)細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。以含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)、傳代、凍存。收集NIH3T3細(xì)胞，以含0.01% FBS的DMEM液饑餓培養(yǎng)12 h后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，采用UltraCULTURETM無(wú)血清培養(yǎng)液，以生理鹽水、TPL預(yù)處理6 h后，加入TGF-β1(5 μg·L-1)刺激NIH3T3細(xì)胞1、2 d，分別收集細(xì)胞及培養(yǎng)液。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè) 引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。收集細(xì)胞，以預(yù)冷的PBS洗滌3次，吸干水分，以Biozol總RNA提取試劑提取細(xì)胞總RNA。NanDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)所有RNA樣品的OD260/OD280吸光度比值(R值)均在1.8～2.2。根據(jù)BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)于冰上配制RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，加入RNA樣品，使用T100TMThermal Cycler基因擴(kuò)增儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。根據(jù)BioEasy SYBR Green Ⅰ RT-PCR Kit說(shuō)明書(shū)，于冰上配制反應(yīng)體系(25 μL)，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2 min；94℃ 變性10 s，57℃退火20 s，40個(gè)循環(huán)。以GADPH作為內(nèi)參，于72 ℃采集熒光信號(hào)，采用2-△△Ct法計(jì)算對(duì)照組和照射組中的表達(dá)水平差異。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequence

1.3.3 ELISA法檢測(cè)Col Ⅰ含量 采用Collagen Ⅰ ELISA試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。以包被緩沖液稀釋Collagen Ⅰ抗體，每孔加0.1 mL，4℃包被過(guò)夜。洗滌緩沖液洗3次，每次3 min；加5%小牛血清白蛋白置37℃封閉40 min，洗滌1次3 min；將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液0.1 mL加入孔中，37℃孵育1 h后，洗滌3次；于各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1 mL，37℃孵育0.5～1 h，洗滌3次；其后加新鮮配制的TMB底物溶液0.1 mL，37℃反應(yīng)10～30 min，加入2 mol·L-1硫酸0.05 mL終止反應(yīng)。酶標(biāo)檢測(cè)儀(EnVision 1900，PerkinElmer，USA)檢測(cè)OD450 nm值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得各孔樣本濃度。

1.3.4 siRNA抑制ERK、Smad3 NIH3T3細(xì)胞在含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液(無(wú)抗生素)中生長(zhǎng)至60%匯合，然后分別轉(zhuǎn)染nontargeting對(duì)照siRNA、si-m-Smad3 (duplex1，20 nmol·L-1)或 ERK siRNA(50 nmol·L-1)，采用X-tremeGene siRNA transfection reagent轉(zhuǎn)染試劑。通過(guò)檢測(cè)對(duì)照siRNA(Cy3標(biāo)記)的熒光值(Cellomics Arrayscan VT1, Thermo Scientific, USA)，確定轉(zhuǎn)染效率為80%～85%。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)及處理同普通NIH3T3。

1.3.5 Western blot檢測(cè)蛋白含量 收集的細(xì)胞以預(yù)冷PBS洗滌3次，加入200～300 μL的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min，期間反復(fù)震蕩3～4次；4℃、10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清(即總蛋白)，BCA法測(cè)定蛋白含量；上清中加4×SDS上樣緩沖液，沸水浴5 min，-20℃保存。制備聚丙烯酰胺凝膠(分離膠：10%)，每孔蛋白上樣量約40 μg，電泳分離樣本蛋白質(zhì)。以300 mA濕法電轉(zhuǎn)至PVDF膜，將膜置于5%小牛血清白蛋白中封閉1 h；一抗[anti-α-SMA、anti-phospho-ERK1/2、anti-ERK1/2、anti-phospho-Smad3(Ser208)、anti-phospho-Smad3(Ser423)、anti-Smad3]用封閉液稀釋后覆蓋PVDF膜上于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次5 min；將1 ∶5 000稀釋的二抗加于PVDF膜上，室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，每次5 min；其后加入ECL試劑顯色，以Image Station 4000MM成像儀(DL Naturegene Life Sciences，USA)成像。蛋白條帶灰度值采用ImageJ軟件分析。

-20℃凍存的小鼠肺組織樣本剪成碎塊，置于預(yù)冷RIPA裂解液中(每克組織加3mL RIPA液)，于冰上勻漿并裂解30 min，其后操作同細(xì)胞樣本。

1.3.6 小鼠肺照射模型 C57BL/6小鼠[♀，8周齡，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002]，氯胺酮麻醉(80 mg·kg-1，ip)，以特制夾具保證小鼠肺處在輻射場(chǎng)中，15 Gy全肺照射。照射小鼠隨機(jī)分組，每組8只，分為對(duì)照組(生理鹽水)和TPL組(0.25 mg·kg-1, iv，隔日1次)，給藥1個(gè)月(給藥劑量及療程由前期實(shí)驗(yàn)確定[8])。設(shè)正常小鼠平行對(duì)照。照射后4～5個(gè)月出現(xiàn)放射性肺纖維化[3]，本實(shí)驗(yàn)于照射后35～37 d終止實(shí)驗(yàn)，頸椎脫臼處死小鼠，取肺組織樣本進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。其中約1/4肺組織低溫勻漿(每克組織加3 mL PBS液)，以ELISA法檢測(cè)TGF-β1 、Col Ⅰ含量；余下部分用于Western blot檢測(cè)(見(jiàn)“1.3.5”項(xiàng))。所有動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)均通過(guò)福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 TPL減少TGF-β1誘導(dǎo)的MFBs活化 經(jīng)TGF-β1(5 μg·L-1)誘導(dǎo)后，NIH3T3細(xì)胞中α-SMA及Col Ⅰ的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)均明顯增加(Pro-Col Ⅰ為Col Ⅰ未交聯(lián)前的可溶態(tài))，即TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化為MFBs，建立了體外促M(fèi)FBs活化的模型。TPL 2.5、5 μg·L-1可明顯抑制α-SMA及Col Ⅰ的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)α-SMA水平，減少Pro-Col Ⅰ的分泌，從而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的MFBs活化(Fig 1)。

2.2 TPL抑制MFBs形成與抑制ERK/Smad3(Ser208)和Smad3(Ser423)的磷酸化活化有關(guān) Western blot結(jié)果顯示(Fig 2A、2B)，TGF-β1誘導(dǎo)可上調(diào)成纖維細(xì)胞中p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)水平，顯示ERK/Smad3信號(hào)通路的激活。

TGF-β1/Smad3通路是促α-SMA表達(dá)、Col Ⅰ合成(即MFBs活化)的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)利用siRNA觀察ERK對(duì)TGF-β1/Smad3的調(diào)節(jié)作用，以及ERK、Smad3在MFBs活化中的地位。Fig 3B顯示，ERK siRNA可抑制Smad3(Ser208)的磷酸化，而對(duì)p-Smad3(Ser423)水平無(wú)明顯影響，表明經(jīng)TGF-β1激活的ERK可致Smad3連接區(qū)磷酸化。ERK siRNA及Smad3 siRNA均可明顯抑制TGF-β1刺激的α-SMA表達(dá)和Col Ⅰ合成，減少M(fèi)FBs活化。siRNA結(jié)果表明，ERK可通過(guò)磷酸化Smad3連接區(qū)Ser208，參與調(diào)節(jié)Smad3的功能，從而部分影響MFBs活化；Smad3 siRNA則直接抑制Smad3的活性，明顯減少M(fèi)FBs活化(Fig 3C、3D)。

經(jīng)TPL(2.5、5 μg·L-1)預(yù)處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的ERK、Smad3(Ser208)、Smad3(Ser423)磷酸化均明顯受抑制(Fig 2A、2B)。綜上，抑制TGF-β1下游ERK的活化，從而下調(diào)p-Smad3(Ser208)，以及減少p-Smad3(Ser423)磷酸化，是TPL減少TGF-β1誘導(dǎo)的MFBs活化的重要途徑。

2.3 TPL對(duì)照射后小鼠肺組織中TGF-β1/ERK/Smad3通路的影響 放射性肺纖維化的形成需4～5個(gè)月。在肺部照射1個(gè)月后，TGF-β1含量較正常對(duì)照組明顯升高(數(shù)據(jù)未顯示)，α-SMA表達(dá)增多(Western blot結(jié)果見(jiàn)Fig 4A，流式及免疫組化結(jié)果見(jiàn)已發(fā)表數(shù)據(jù)[8])，顯示存在多量MFBs活化，此時(shí)Col Ⅰ的合成尚未明顯增多(Fig 4B)，無(wú)明顯基質(zhì)沉積[8]，表明放射性肺纖維化尚處在發(fā)生的早期，活化形成的MFBs分泌的Col Ⅰ尚未累積到一定量。檢測(cè)TGF-β1/ERK/Smad3通路狀況，顯示p-ERK、p-Smad3(Ser208)、p-Smad3(Ser423)水平均明顯上調(diào)(Fig 4C、4D)。

TPL 0.25 mg·kg-1靜脈給藥1個(gè)月，可明顯減少照射后肺組織TGF-β1含量，抑制ERK、Smad3(Ser208)、Smad3(Ser423)的磷酸化活化，下調(diào)α-SMA表達(dá)，即減少M(fèi)FBs的活化(Fig 4)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了TPL可通過(guò)抑制TGF-β1/ERK/Smad3途徑，減少M(fèi)FBs數(shù)量，從而抑制纖維化的進(jìn)展。

Fig 1 TPL suppressed activation of MFBs induced by TGF-β1

A:α-SMA mRNA in NIH3T3 cells assayed by RT-PCR;B:Col Ⅰ mRNA in NIH3T3 cells assayed by RT-PCR;C:The protein level of α-SMA detected by Western blot;D:The quantity of Col Ⅰ in culture medium measured by ELISA. TPL 2.5 and TPL 5 reflex TPL 2.5 μg·L-1and 5 μg·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle

Fig 2 TPL regulated TGF-β1/ERK/Smad3 pathway

A:The phosphorylations of ERK and Smad3 detected by Western blot;B:The protein band density recognized by ImageJ software, and the results presented as ratio.TPL 2.5 and TPL 5 reflex TPL 2.5 μg·L-1and 5 μg·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle

Fig 3 ERK siRNA and Smad3 siRNA inhibited transformation of MFBs from fibroblasts

A:ERK siRNA and Smad3 siRNA effectively knockdowned the expression of ERK and Smad3 respectively;B:Effect of ERK siRNA on the protein level of p-Smad3(Ser208) and p-Smad3(Ser423);C:ERK siRNA and Smad3 siRNA downregulated the level of α-SMA;D:ERK siRNA and Smad3 siRNA reduced the synthesis of Col Ⅰ.**P<0.01vscontrol without TGF-β1；#P<0.05,##P<0.01vscontrol with TGF-β1;△P<0.05vsERK siRNA with TGF-β1

Fig 4 TPL suppressed MFBs activation and TGF-β1/ERK/Smad3 pathway in lung tissue after radiation for 1 month

A:The level of α-SMA in lung tissue measured by Western blot;B:The quantity of Col I in lung tissue assayed by ELISA;C:The phosphorylation of ERK and Smad3 detected by Western blot;D:The protein band density analyzed by ImageJ software, and the results presented as ratio.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsvehicle

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)TPL可抑制放射性肺纖維化中TGF-β1誘導(dǎo)的MFBs活化。多種細(xì)胞因子可促進(jìn)MFBs的活化，如TGF-β1、ROS、CTGF、PDGF等，而這些因子主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及MFBs本身[6,15]。前期研究發(fā)現(xiàn)，照射后肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞以旁分泌形式刺激鄰近的成纖維細(xì)胞活化為MFBs，TPL可下調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞分泌的ROS、減弱其旁分泌作用，減少M(fèi)FBs的活化[8]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察TPL對(duì)常見(jiàn)促M(fèi)FBs活化的TGF-β1/Smad3途徑的影響。結(jié)果表明，TPL可抑制成纖維細(xì)胞及肺組織中的Smad3磷酸化激活，減少M(fèi)FBs經(jīng)TGF-β1途徑活化，并下調(diào)Col I的分泌量，減少基質(zhì)沉積，抑制纖維化的進(jìn)展。綜合我們的結(jié)果顯示，TPL的抗放射性肺纖維化作用為多靶點(diǎn)效應(yīng)，對(duì)MFBs的活化具有多水平阻斷作用：既具有細(xì)胞水平的調(diào)節(jié)作用(巨噬細(xì)胞)，也表現(xiàn)分子水平的阻斷作用。同時(shí)，在分子水平具有多靶點(diǎn)作用，可抑制促纖維化因子ROS以及TGF-β1的作用，減少M(fèi)FBs的活化。

TPL減少照射后早期MFBs的形成，可抑制纖維化的緩慢發(fā)展。放射性肺纖維化是慢性發(fā)生過(guò)程，小鼠放射性肺纖維化的形成需4～5個(gè)月，而TPL(0.25 mg·kg-1, iv隔日1次)給藥1個(gè)月后停藥，可以明顯緩解其后肺組織的結(jié)構(gòu)變化[3]。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)[8]及本實(shí)驗(yàn)相關(guān)機(jī)制研究的結(jié)果顯示，TPL通過(guò)其多水平、多靶點(diǎn)的強(qiáng)效抑制作用，明顯減少照射后MFBs的形成，從而減弱基質(zhì)沉積、結(jié)構(gòu)紊亂、順應(yīng)性下降等病理改變，達(dá)到緩解肺纖維化的效果。

本實(shí)驗(yàn)提出ERK可能通過(guò)調(diào)節(jié)Smad3連接區(qū)磷酸化參與調(diào)節(jié)α-SMA的表達(dá)。TGF-β1/Smad2/3通路介導(dǎo)了復(fù)雜多樣的甚至對(duì)立的功能調(diào)節(jié)，如既有促進(jìn)干細(xì)胞多能性，又有刺激干細(xì)胞分化的作用等[16]。目前已了解TGF-β1/Smad2/3通路的效應(yīng)受到多因子、多水平的調(diào)節(jié)，使得在特定的細(xì)胞類型、細(xì)胞外環(huán)境下引起特定的基因表達(dá)、蛋白合成，參與相關(guān)的生理或病理過(guò)程[16]。在促進(jìn)纖維細(xì)胞增生、Col Ⅰ表達(dá)、合成的過(guò)程中，TGF-β1/Smad2/3通路主要受到ERK的調(diào)節(jié)[13,17-18]。由于纖維細(xì)胞的增生、合成Col Ⅰ能力增強(qiáng)是纖維細(xì)胞活化為MFBs的重要表現(xiàn)，故本實(shí)驗(yàn)觀察ERK對(duì)MFBs活化標(biāo)志物α-SMA表達(dá)的影響。使用siRNA阻斷ERK活性，可下調(diào)α-SMA的表達(dá)及Col Ⅰ的合成，顯示ERK確實(shí)參與了α-SMA的表達(dá)和MFBs的活化。同時(shí)，ERK siRNA僅下調(diào)p-Smad3(Ser208)水平，而對(duì)Smad3(Ser423)的磷酸化無(wú)明顯影響，表明ERK對(duì)α-SMA表達(dá)水平的影響可能與ERK磷酸化Smad3連接區(qū)(Ser208)，從而增強(qiáng)C端磷酸化的Smad3(Ser423)的促基因轉(zhuǎn)錄作用有關(guān)。進(jìn)一步確定ERK對(duì)TGF-β1/Smad3途徑的調(diào)節(jié)，還需在Smad3敲除的成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ERK，觀察成纖維細(xì)胞的活化水平。

本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道TPL的抗放射性肺纖維化作用與抑制TGF-β1/ERK/Smad3途徑，減少M(fèi)FBs活化部分相關(guān)。并提出ERK可能通過(guò)磷酸化Smad3連接區(qū)參與調(diào)節(jié)Smad3功能，影響α-SMA、Col I的表達(dá)，進(jìn)而影響MFBs的活化。我們的研究顯示，TPL在放射性肺纖維化應(yīng)用方面極具潛力。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在福建醫(yī)科大學(xué)福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室的各位老師及同學(xué)的幫助致以衷心的感謝！)

[1] Dicarlo A L,Jackson I L,Shah J R, et al. Development and licensure of medical countermeasures to treat lung damage resulting from a radiological or nuclear incident[J].RadiatRes, 2012,177(5):717-21.

[2] Wynn T A, Ramalingam T R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease[J].NatMed, 2012, 18(7): 1028-40.

[3] Yang S M, Zhang M,Chen C, et al. Triptolide mitigates radiation-induced pulmonary fibrosis[J].RadiatRes, 2015, 184(5):509-17.

[4] Abraham D J, Eckes B, Rajkumar V, Krieg T. New developments in fibroblast and myofibroblast biology: implications for fibrosis and scleroderma[J].CurrRheumatolRep, 2007, 9(2):136-43.

[5] Yarnold J, Brotons M C. Pathogenetic mechanisms in radiation fibrosis[J].RadiotherOncol, 2010, 97(1):149-61.

[6] Friedman S L. Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Gastroenterology, 2008,134(6):1655-69.

[7] Barnes J L, Gorin Y. Myofibroblast differentiation during fibrosis: role of NAD(P)H oxidases[J].KidneyInt, 2011, 79(9):944-56.

[8] Chen C, Yang S M, Zhang M, et al.Triptolide mitigates radiation-induced pulmonary fibrosis via inhibition of axis of alveolar macrophages-NOXes-ROS-myofibroblasts[J].CancerBiolTher, 2016,17(4):381-9.

[9] Klingberg F, Chow M L, Koehler A, et al. Prestress in the extracellular matrix sensitizes latent TGF-β1 for activation[J].JCellBiol, 2014, 207(2):283-97.

[10]Reisdorf P, Lawrence D A, Sivan V, et al. Alteration of transforming growth factor-beta1 response involves down-regulation of Smad3 signaling in myofibroblasts from skin fibrosis[J].AmJPathol, 2001, 159(1): 263-72.

[11]Hayashida T,Decaestecker M， Schnaper H W. Cross-talk between ERK MAP kinase and Smad signaling pathways enhances TGF-beta-dependent responses in human mesangial cells[J].FASEBJ, 2003, 17(11):1576-8.

[12]Blanchette F, Rivard N, Rudd P, et al. Cross-talk between the p42/p44 MAP kinase and Smad pathways in transforming growth factor beta 1-induced furin gene transactivation[J].JBiolChem, 2001, 276(36): 33986-94.

[13]Li F, Fan C, Cheng T, et al. Efficient inhibition of fibroblast proliferation and collagen expression by ERK2 siRNAs[J].BiochemBiophyResCommun, 2009,382(2):259-63.

[14]Stone H B, Coleman C N, Anscher M S,et al. Effects of radiation on normal tissue: consequences and mechanisms[J].LancetOncol, 2003, 4(9): 529-36.

[15]Wynn T A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis[J].JPathol, 2008, 214(2):199-210.

[16]Massague J. TGFbeta signalling in context[J].NatRevMolCellBiol, 2012,13(10): 616-30.

[17]Hayashida T, Wu M H, Pierce A, et al. MAP-kinase activity necessary for TGFbeta1-stimulated mesangial cell type I collagen expression requires adhesion-dependent phosphorylation of FAK tyrosine 397[J].JCellSci, 2007, 120(Pt 23): 4230-40.

[18]Ponticos M, Holmes A M, Shi-wen X, et al. Pivotal role of connective tissue growth factor in lung fibrosis:MAPK-dependent transcriptional activation of type Ⅰ collagen[J].ArthritisRheum, 2009, 60(7):2142-55.

TPL’s suppression on activation of myofibroblasts in radiation induced lung fibrosis related to its inhibition on TGF-β1/ERK/Smad3 pathway

ZHANG Yan-wei1, ZHANG Zhi-qiang1,2,3, WU Li-xian1,2,3, ZHANG Lu-rong4,5, CHEN Chun1,2,3
(1.DeptofPharmacology,2.InstituteofMateriaMedica,3.FujianKeyLaboratoryofNaturalMedicinePharmacology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350122,China;4.theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China;5.KeyLaboratoryofRadiationBiology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China)

Aim To observe the correlation between the TPL’s suppression on myofibrolbasts(MFBs) activation and TGF-β1/ERK/Smad3 pathway by performinginvivoandinvitroexperiments.MethodsInvitromodel of MFBs activation was set up by stimulating fibroblasts with TGF-β1, andinvivomodel of MFBs activation in radiated lung tissue was built by thoracic radiation on C57BL/6 mice. MFBs activation was analyzed by detecting the expression of α-SMA(using RT-PCR and Western blot) and Col Ⅰ(using RT-PCR and ELISA methods). The levels of p-ERK, p-Smad3(Ser208) and p-Smad3(Ser423) were measured by Western blot. ERK siRNA and Smad3 siRNA were used to observe the status of ERK and Smad3 in MFBs activation.Results TGF-β1 activated p-ERK/p-Smad3(Ser208) and p-Smad3(Ser423), increased the expression of α-SMA and synthesis of Col Ⅰ, which indicated MFBs activation. siRNA knockdown assay showed that both ERK and Smad3 were involved in regulating the levels of α-SMA and Col Ⅰ, and ERK influenced MFBs transformation possibly through its phosphorylation of Smad3(Ser208). TPL treatment inhibited the phosphorylation activation of ERK, Smad3(Ser208), Smad3(Ser423)invitroandinvivo, therefore significantly reduced the level of α-SMA and Col Ⅰ, and the number of activated MFBs was decreased.Conclusion TPL mitigates radiation-induced pulmonary fibrosis by inhibiting the activation of MFBs, which is partly through suppressing TGF-β1/ERK/Smad3 pathway.

triptolide;radiation induced pulmonary fibrosis; myofibroblast; α-smooth muscle actin; type Ⅰ collagen;transforming growth factor β1(TGF-β1); ERK; Smad3

2017-02-14,

2017-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81473264)；福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(No wzze201308)；福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No 2014J01336)

張彥偉(1994-)，女，碩士生，研究方向：天然藥物藥理學(xué)，E-mail: 2453181338@qq.com; 陳 純(1971-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物藥理學(xué)、放射保護(hù)藥理學(xué)，通訊作者，Tel:0591-22862016, E-mail:chenchun-0428@163.com

時(shí)間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.018.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.009

A

1001-1978(2017)05-0630-07

R329.25；R563.102.2；R563.130.22；R818；R977.6