基于TLR4-NF-κB 的柴胡黃芩水煎液抑制CCl4誘導大鼠肝星狀細胞激活作用機制研究

李 敏，韓 艷，王華林，王義雯，李 靜，王 斌

(陜西中醫藥大學藥學院 ，陜西 西安 712046)

基于TLR4-NF-κB 的柴胡黃芩水煎液抑制CCl4誘導大鼠肝星狀細胞激活作用機制研究

李 敏，韓 艷，王華林，王義雯，李 靜，王 斌

(陜西中醫藥大學藥學院 ，陜西 西安 712046)

目的 探討柴胡黃芩水煎液(CQ)對CCl4誘導肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活的作用及機制。方法 取對數生長的HSC，在無血清培養基中培養24 h后，以1.5×109·L-1濃度接種到培養板中過夜。實驗分組如下：空白對照組(無藥物處理)，CCl4誘導組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h)，給藥組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用400、500、600 mg·L-1的CQ作用24 h)，TLR4阻斷劑TAK-242、NF-κB阻斷劑BAY 11-7082組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用TAK-242 10 mol·L-1、BAY 11-7082 2 mol·L-1作用24 h)。處理之后，應用ELISA法檢測培養基中透明質酸酶(hyaluronidase，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)濃度，RT-PCR方法檢測細胞中Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)、核轉錄因子κB(NF-κB)基因的表達，應用Western blot法檢測細胞中TLR4、NF-κB蛋白的表達。結果 研究發現，與CCl4干預組比較，CQ量效相關性降低CCl4誘導的HSC增殖。600 mg·L-1的CQ可以明顯降低HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C細胞釋放水平及TLR4、NF-κB基因、蛋白的表達。NF-κB抑制劑TAK-242、BAY 11-7082也可降低CCl4造成的HSC增殖，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C細胞釋放水平及NF-κB基因、蛋白表達，不能下調TLR4基因、蛋白表達。結論 CQ可以抑制CCl4誘導的炎癥因子基因、蛋白表達，減輕肝纖維化相關指標的含量，其作用機制可能與TLR4-NF-κB轉錄活性及蛋白活性相關，提示其在抗肝纖維中的作用及機制。

肝纖維化；柴胡-黃芩水煎液；HSC；CCl4誘導；TLR4；NF-κB

肝纖維化是多種肝損傷發展過程中的一種病理狀態,肝纖維化過程中肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)持續激活是肝纖維化發展過程中的關鍵環節。HSC在多種因素刺激后被激活轉換成為肌成纖維樣細胞，細胞大量增殖，合成細胞外基質(extracellular matrix,ECM)并在肝臟過度沉積,產生肝纖維化[1]。課題組前期研究表明，柴胡黃芩配伍水煎液(CQ)對大鼠肝纖維化模型有良好的保護作用[2]，對四氯化碳(CCl4)損傷L02細胞有良好的保護作用[3]。在此基礎上，本研究進一步觀察柴胡黃芩水提液對HSC增殖的影響以及干預CCl4誘導活化HSC的作用。從體內TLR4-NF-κB信號通路的角度闡釋柴胡黃芩水煎液抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6，購自灝洋生物公司；改良型RPMI 1640培養基，購自博士德生物科技公司；胎牛血清，購自Hyclone公司；胰酶，購自Trypsin。TAK-242購自 InvivoGen 公司；BAY 11-7082購自江蘇碧云天生物工程公司；透明質酸酶(hyaluronidase，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)檢測試劑盒購自北京永輝生物科技有限公司；TLR4、NF-κB p65一抗、二抗購自武漢博士德生物工程公司。CO2培養箱:新加坡ESCO；倒置顯微鏡: 奧特BDS200；酶標儀: 美國BioTek ELx808；離心機: 湘儀L530；雙人型超凈工作臺：新加坡ESCO。

1.2 實驗藥品

1.2.1 柴胡黃芩配伍水提液 中藥材柴胡和黃芩購自陜西中醫藥大學校醫院中藥房，經鑒定為正品。參照文獻及前期實驗結果，稱取柴胡50 g和黃芩25 g，用水浸泡30 min后，以8倍水煎煮2次，將2次水提液混勻濃縮至75 mL。

1.2.2 CCl4溶液的制備 將100 μL CCl4與100 μL DMSO混勻，再用無血清培養基稀釋，使其終濃度為6 mmol·L-1。

1.3 大鼠HSC培養及藥物處理 大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)于改良型RPMI 1640培養基(含10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)，37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養并傳代。取對數生長的HSC，在無血清培養基中培養24 h后，以1.5×109·L-1濃度接種到培養板中過夜。實驗分組如下：空白對照組(無藥物處理)，CCl4誘導組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h)，給藥組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用400、500、600 mg·L-1的CQ作用24 h)，TLR4阻斷劑TAK-242、NF-κB阻斷劑BAY 11-7082組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用TAK-242 10 mol·L-1、BAY 11-7082 2 mol·L-1作用24 h)。

1.4 CQ對CCl4誘導活化的HSC增殖的影響 各組培養24 h后，加入5 g·L-1MTT 10 μL，37℃孵育4 h，吸棄孔內培養液，每孔加入DMSO 150 μL,低速震蕩10 min，以溶解被還原的MTT結晶，酶標儀單波長檢測各孔吸光度值，按下列公式計算大鼠HSC增殖抑制率。細胞抑制率/%=[1-(實驗組A值/對照組A值)]×100%。

1.5 CQ對CCl4誘導活化的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 各組培養24 h后，收集細胞培養液，參照試劑盒使用說明書，應用ELISA法檢測HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量。

1.6 CQ對CCl4誘導活化的HSC細胞TLR4和NF-κB p65的mRNA水平的影響 各組培養24 h后，棄去上清液，胰酶消化收集，至少以1×106個為樣本檢測量。孵育24 h后抽提細胞總RNA，去除DNA污染后，通過RT-PCR的方法，檢測TLR4和NF-κB p65 mRNA表達，PCR引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

1.7 CQ對CCl4誘導活化的HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達的影響 各組培養24 h后，棄去上清液，胰酶消化收集，PBS洗滌2次，加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑充分裂解，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，細胞總蛋白加上樣緩沖液煮沸變性，用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫雜交2 h，洗膜后，加入ECL發光液，進行檢測，觀察結果并掃描分析。TLR4和NF-κB p65蛋白表達水平用目的條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內參GAPDH蛋白條帶的IA比值定量表示。

2 結果

2.1 CQ對CCl4誘導活化的HSC增殖的影響 與空白對照組比較，CCl4干預后，明顯促進HSC增殖(P<0.01)，CQ對CCl4誘導的HSC增殖具有明顯抑制作用，特別是劑量為600 mg·L-1時，作用最為明顯；TAK-242和BAY 11-7082也對CCl4誘導的HSC增殖具有明顯抑制作用。見Tab 2。

GroupDoseODvalueNormal-0．32±0．14??CCl46mmol·L-10．54±0．08CQ600mg·L-10．33±0．06??500mg·L-10．36±0．07?400mg·L-10．40±0．08?TAK?24210mol·L-10．31±0．15?BAY11?70822mol·L-10．33±0．10??

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

2.2 CQ對CCl4誘導活化的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 與空白對照組比較，CCl4干預后，HSC細胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯升高，CQ、TAK-242 和BAY 11-7082對CCl4誘導的HSC細胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C具有明顯抑制作用，特別是CQ劑量為600 mg·L-1時，作用最為明顯。見Tab 3。

2.3 RT-PCR檢測大鼠HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA表達 與空白對照組比較，CCl4干預后，HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA表達增強，CQ和BAY 11-7082對CCl4誘導的HSC細胞TLR4和NF-κB p65 mRNA表達有下調作用，TAK-242對CCl4誘導的HSC細胞NF-κB p65 mRNA表達有下調作用，其中CQ 600 mg·L-1組、TAK-242和BAY 11-7082組差異有統計學意義(P<0.05)，見Tab 4。

2.4 Western blot法檢測HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達 與空白對照組比較，CCl4干預后，HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達增強，CQ、TAK-242對CCl4誘導的HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達有下調作用，BAY 11-7082對CCl4誘導的HSC中NF-κB p65蛋白表達有下調作用，其中CQ 600 mg·L-1、TAK-242和BAY 11-7082組差異有統計學意義(P<0.05)，見Tab 5、Fig 1。

GroupDoseHA/μg·L-1Ⅳ?C/μg·L-1LN/μg·L-1PCⅢ/μg·L-1Normal-234．26±29．64??10．69±2．01??42．67±6．28??80．21±7．61??CCl46mmol·L-1498．36±98．0825．34±2．6471．25±10．21142．65±9．92CQ600mg·L-1326．94±72．06?11．54±2．90??46．42±12．03??89．29±10．24??500mg·L-1376．22±69．49?15．02±2．87?56．15±9．52?115．39±10．04?400mg·L-1473．67±72．8423．64±2．9159．21±11．65138．57±11．68TAK?24210mol·L-1259．26±59．37??12．89±2．98?43．24±9．87??90．21±12．54??BAY11?70822mol·L-1309．18±81．65?11．03±1．24??40．21±10．24??84．15±9．34??

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

GroupDoseNF?κBTLR4Normal-20．90±0．50?38．32±2．83?CCl46mmol·L-124．37±0．4742．40±1．55CQ600mg·L-121．34±1．92?40．02±0．03?500mg·L-122．46±0．1842．01±1．19400mg·L-123．45±0．1844．00±0．63TAK?24210mol·L-121．45±1．20?42．19±0．82BAY11?70822mol·L-123．24±0．08?41．19±3．10?

**P<0.01,*P<0.05vsCCl4group

GroupDoseNF?κBTLR4Normal-0．35±0．00?0．20±0．01?CCl46mmol·L-10．80±0．020．60±0．02CQ600mg·L-10．14±0．03??0．16±0．01??500mg·L-10．24±0．02?0．18±0．00?400mg·L-10．61±0．010．16±0．04?TAK?24210mol·L-10．18±0．03?0．14±0．02??BAY11?70822mol·L-10．15±0．02??0．52±0．01

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

Fig 1 Effect of CQ on protein expressions of TLR4,NF-κB in HSC

1: Normal group; 2: CCl4group; 3: CQ 600 mg·L-1group; 4: CQ 500 mg·L-1group; 5: CQ 400 mg·L-1group; 6: TAK-242; 7:BAY 11-7082

3 討論

TLR4是細胞表面識別病原相關分子的一個重要識別受體，該受體激活后能通過信號轉導激活其下游的NF-κB，導致炎性介質大量釋放，引起肝臟損害[4-6]。經刺激活化的HSC是肝纖維化ECM的主要來源細胞。HSC在多種因素刺激后被激活轉換成為肌成纖維樣細胞,細胞大量增殖，合成ECM,并在肝內過量沉積,發生肝纖維化，可見，TLR4-NF-κB信號通路異常與肝損傷關系密切[7-8]。文獻研究[9-11]及課題組前期實驗發現，柴胡黃芩配伍水煎劑有明顯防治大鼠肝纖維化作用，其體內調控機制可能與TLR4-NF-κB信號通路調控的炎癥反應有關[1]。本實驗通過研究柴胡黃芩配伍水煎劑對HSC增殖影響，及對CCl4誘導活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κB p65基因及蛋白表達的影響，探討其抗肝纖維化可能的作用機制。

實驗結果顯示，HSC經CCl4激活，大量增殖,其培養液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯高于空白對照組。可見，CCl4對HSC增殖有一定激活作用，導致肝纖維化相關因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌增加，表現出肝纖維化傾向。給予CQ干預后，HSC增殖受到一定抑制，并且HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也降低，可見，CQ有一定抗肝纖維化作用。通過RT-PCR法和Western blot法檢測CCl4活化后的HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白的表達，與空白組比較，TLR4和NF-κB p65 mRNA表達和蛋白表達均明顯增加，CQ干預后，TLR4和NF-κB p65 mRNA表達和蛋白表達均明顯降低，其中CQ 600 mg·L-1時作用最為明顯。同時，應用TLR4的拮抗劑TAK-242后，TLR4和NF-κB p65 mRNA表達和蛋白表達明顯降低，而應用NF-κB p65拮抗劑BAY 11-7082后，NF-κB p65 mRNA表達和蛋白表達也明顯降低，TLR4 mRNA表達和蛋白表達沒有明顯變化。可見，CQ能夠減輕CCl4激活HSC的增殖，并降低肝纖維化因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其作用機制之一是通過調控TLR4-NF-κB信號通路，具體的調控機制，還需進一步研究。

(致謝：本文實驗在陜西中醫藥大學醫學科研實驗中心完成，在整個研究過程中得到了王宇老師、史迎莉的悉心指導和熱忱幫助，在此次深表謝意！)

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Inhibitory effects ofBupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction on activation of rat HSC induced by CCl4

LI Min, HAN Yan, WANG Hua-lin,WANG Yi-wen,LI Jing,WANG Bin
(CollegeofPharmacy,ShanxiUniversityofChineseMedicine,Xian712046,China)

Aim To investigate the inhibitory effect ofBupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction(CQ) on activation of rat HSC induced by CCl4and the mechanism.Methods Cells in logarithmic growth phase were cultured in culture medium without FBS for 24 h.After disassociated using 0.25% EDTA-trypsin, the cells were seeded into respective plates at the density of 1.5×109· L-1and cultured overnight. The cells were divided into the following groups:control group(no treatment)，model group(treated with 6 mmol·L-1CCl4for 24 h)，CQ groups(pretreated with 6 mmol·L-1CCl4for 24 h and 400,500,600 mg·L-1CQ for 24 h). Concentrations of hyaluronidase(HA), laminin(LN), procollagen Ⅲ(PCⅢ),collagen type Ⅳ(Ⅳ-C) were assayed by ELISA kits. Gene expressions of Toll-like receptor 4 (TLR4) and NF-κB were examined by RT-PCR analysis. Protein expression of TLR4 and NF-κB was examined by Western blot.Results CQ could significantly inhibit cell proliferation induced by CCl4. Furthermore, CQ at 600 mg·L-1significantly downregulated gene and protein expressions of TLR4 and NF-κB. And CQ reduced the secretion of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C. Further studies disclosed that the TLR4 inhibitor TAK-242 and NF-κB inhibitor BAY 11-7082 could significantly inhibit the gene and protein expressions of NF-κB，but could not change gene and protein expression of TLR4,and reduced the secretion of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C. Conclusion CQ could inhibit inflammatory responses in HSC induced by CCl4probably by inhibiting the transcription activity and protein expression of TLR4-NF-κB, which indicates its possible therapeutic effect on liver fibrosis.

liver fibrosis;Bupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction; HSC; induced by CCl4; TLR4; NF-κB

2016-12-28,

2017-01-22

陜西省科技廳項目(No 2013jk4023)； 陜西省中醫藥管理局項目(No zy06)；陜西省教育廳項目(No 12JK1016)

李 敏(1978-)，女，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥基礎理論，E-mail：413159921@qq.com； 王 斌(1978-)，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：中醫藥抗腦缺血，通訊作者，E-mail：wangbin812@126.com

時間：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.026

A

1001-1978(2017)05-0729-04

R-332；R282.71；R283.6；R322.47；R392.11；R575.2；R977.6