糖尿病周圍神經病變實驗動物模型研究進展

饒軍華 ， 徐世千 ， 孫云霄 ， 張洪鈿 ， 李比海 ， 肖百全

(廣東省生物資源應用研究所 廣東省動物保護與資源利用重點實驗室廣東省野生動物保護與利用公共實驗室 ， 廣東 廣州 510260)

糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是一種嚴重威脅人類健康的慢性疾病[1]，該疾病本身對機體的損傷有限，其眾多的并發癥是人類健康的主要威脅，嚴重影響患者的生存質量，甚至危及患者生命。DM的主要并發癥主要包括神經病變、腎病、眼病、心臟病等。據統計，50%以上的糖尿病患者都患上以上一種或幾種并發癥[2]。糖尿病周圍神經病變(Peripheral Diabetes Neuropathy, PDN)是糖尿病的主要并發癥之一，發病率(60%～70%)高[2]，對患者的損傷大，臨床以對稱性麻木、電擊樣疼痛、腹脹、汗出等表現為主，特別是持續性蟻(蟲)爬狀麻木和電擊樣疼痛嚴重影響患者的生存質量[3]，后果極其嚴重。

自20世紀60年代起，國內外學者開始對 PDN進行研究，但由于其發病的復雜性，迄今為止， PDN的發病機制仍未被破解，該領域的動物模型研究的成熟度也相對較低，這給治療 PDN藥物的研發也帶來了較大的障礙。目前，多數學者認為 PDN的發病與周圍神經的神經端退化、脫髓鞘有關[4]，當患者的周圍神經進行性出現末梢到近端震動和熱感知閥值上調，患者繼而出現疼痛、體虛、感覺缺失[2]等異常感覺。雖然 PDN的發病機制尚不清晰，但國內外學者并未停止對該領域進行研究，數十年來進行了大量的試驗，本文就國內外學者對 PDN模型的研究進行總結，發現各模型的優勢和不足，為后續研究者對 PDN模型研究以及 PDN藥物的研發提供借鑒。

1 PDN動物模型及其優缺點比較

1.1 自發性PDN模型

1.1.1 高脂飼料誘導PDN雌性C57BL6/J小鼠模型 2007年Obrosova[5]等采用高脂飼料飼喂雌性C57BL6/J小鼠16周后誘導出糖尿病前期及肥胖C57BL6/J小鼠模型并使其罹患PDN，該模型與人的糖尿病前期患者和肥胖患者相似。高脂誘導的小鼠出現周圍神經功能異常，但其結果并未改變，該模型適合在糖尿病早期評估飲食或藥理學方法阻止或逆轉糖尿病神經病變的效果。該模型的優點：運動和感覺神經傳導不暢，有觸摸痛及熱痛覺遲鈍。缺點：(1)皮內神經纖維減少，軸突萎縮；(2)不能用于慢性糖尿病神經病變研究；(3)尚未被治療PDN的藥物驗證。

1.1.2 自發性T1DM PDN Ins2 Akita小鼠模型 Choeiri等[6-7]研究發現，34周齡以上的高血糖癥小鼠若不控制血糖將出現周圍神經病變。該動物模型胰島β細胞數量減少，伴隨高胰島素血癥，感覺神經傳導速度(SNCV)降低。該模型的優點：(1)屬自發性糖尿病模型，與人類 PDN并發癥出現相似度較高；(2)進行性和持續慢性高血糖癥；(3)感覺神經傳導速度降低；(4) 樹突和軸突明顯膨脹；(5)發病機制與其他齒嚙類動物和人相似。其缺點是尚未被治療糖尿病或PDN的藥物驗證。

1.1.3 瘦素不足的PDN (ob/ob)小鼠模型 2006年Drel等[8]研究發現，給ob/ob小鼠飼喂普通小鼠飼料并保持中等程度高血糖癥時，動物的運動和感覺神經傳導明顯減緩，并累及周圍神經山梨醇通路的中間產物的代謝。造模至第11周時，表皮內神經纖維急劇減少(約78%)。該模型已成功用于PDN藥物醛糖還原酶抑制劑的評估。其優點：(1)有明顯熱痛覺遲鈍反應；(2)非禁食血糖水平相對較高；(3)降低運動和感覺神經傳導；(4)明顯降低表皮內神經纖維；(5)已被治療PDN的藥物驗證。其缺點是還不能廣泛地用于治療糖尿病或PDN藥物的藥理學篩選。

1.1.4 自發性糖尿病PDN WBN/Kob大鼠模型 1993年Yagihashi等[9]通過檢測12～20月齡的大鼠電生理、生化及外周神經結構變化，發現了一種自發性糖尿病大鼠PDN模型。自發性糖尿病WBN/Kob大鼠會出現髓鞘脫落, 病癥以運動神經病變為主，后期伴隨軸突的變化。該模型的優點：(1)減慢運動神經傳導，合成肌肉動作電位暫時性消失；(2)在12個月齡時，結構性脫髓鞘或髓鞘再生；(3)軸突變性，代謝紊亂，或在20個月齡時有髓鞘纖維減少；(4)類似于人的周圍神經病變發病機理。其缺點是尚未被治療PDN的藥物驗證。

1.1.5 自發性糖尿病PDN恒河猴模型 1989年Cornblath等[10]曾嘗試建立自發性糖尿病恒河猴PDN模型。他們發現，與非糖尿病動物相比，糖尿病動物能顯著降低運動神經傳導速度(MNCV)并延遲F波的出現。此外，糖尿病組動物自出現高血糖癥起2年內運動纖維的神經傳導次數增加。該模型的優點：(1)明顯減少運動傳導速度；(2)延長F波的峰潛時；(3) 發病機制與人類相似，國內動物資源較豐富。其缺點：(1)運動誘發的振幅無區別；(2)延長神經傳導誘導時間(約2年)；(3)尚未被治療PDN的藥物驗證。

1.1.6 遺傳性PDN中國倉鼠模型 1982年Kennedy等[11]對遺傳性的糖尿病中國倉鼠周圍神經病變模型并其解剖學及生理學進行了研究發現：中國倉鼠后肢神經的運動和感覺組份降低了16%～22%，但神經纖維直徑未減少并且與生理效應相關形態學指標均正常。該模型的優點：適于作為PDN模型。缺點是：(1)PDN病變與人類的相似度不高，不及人類糖尿病神經病變的臨床癥狀嚴重；(2)尚未被治療PDN的藥物驗證。

1.2 化學藥物誘導的PDN模型

1.2.1 STZ誘導的PDN小鼠模型 1978年Robertson等[12]用STZ誘導基因突變的C57BL/Ks (db/db)小鼠獲得PDN模型。該模型初期出現運動神經傳導速度(MNCV)嚴重降低，缺少大的有髓神經纖維、軸突萎縮癥狀；末期在有髓或無髓纖維中可觀察到軸突營養障礙，并伴隨髓鞘受損、收縮及分解等情況。該模型的優點: (1) 明顯降低運動神經傳導速度(MNCV)；(2)缺乏大量的髓鞘纖維；(3) 軸突萎縮；(4)有髓鞘纖維和無髓鞘纖維的軸突營養缺陷；(5)髓磷脂減少、萎縮或崩潰。缺點：動物被STZ損傷過，與人類1型糖尿病的發病機理比較相似，與人類2型糖尿病的發病具有比較大的差異，此外該模型也尚未被治療糖尿病或PDN的藥物驗證。

1.2.2 STZ誘導的PDN大鼠模型 2006年Rodrigues F O等[13]將STZ單次注入10只大鼠皮下，大鼠出現血糖升高并出現了PDN癥狀。糖尿病大鼠的膈神經與對照組相比，有髓軸突的直徑變小。該研究證實，常規的胰島素治療能預防或糾正有髓鞘軸突神經細胞的變性。該模型的優點：(1)可以明顯地減少左右叢生區及膈神經髓鞘的形成；(2)可以用于胰島素的驗證。其缺點：(1)PDN的特征仍不清楚；(2)動物模型為血清胰島素分泌絕對不足型模型，與人類的 PDN的發病存在一定的差異，雖然可以用胰島素驗證，但尚未用于治療PDN藥物的篩選和驗證。

1.2.3 STZ誘導的PDN C57BL6/J 小鼠模型 2008年Vareniuk等[14]采用單劑量(100 mg/kg體重)STZ注射到非禁食的野生型和iNos基因缺陷型小鼠，6個月后誘導出C57BL6/J 小鼠PDN模型。研究發現，iNos基因在糖尿病神經病變的周圍神經、結構與功能變化的過氧亞硝酸基受損中起關鍵作用。該模型的優點：(1)周圍神經和背根神經細胞的過氧亞硝酸基受損；(2)運動和感覺神經傳導速度降低，熱和機械感覺過敏，觸覺異常，內表皮神經纖維。其缺點是尚未被治療PDN藥物的驗證。

1.2.4 STZ誘導的糖尿病感覺神經病變ddY小鼠模型 2013年Murakamil等[15]將STZ單次注射到8周齡的ddY小鼠(1周后血糖升高到16.7 mmol/L)，他們制備出感覺神經病變ddY小鼠模型。該模型的優點：(1)可明顯降低感覺神經傳導速度，更高的疼痛閥值，痛覺遲鈍，無髓鞘纖維萎縮；(2)成功地用于胰島素治療評估；(3)可作為人類多發性神經病變研究的一種比較好的模型。缺點是在髓鞘神經纖維區域無明顯變化。

1.2.5 蔗糖誘導的PDN OLETF大鼠模型 2006年Kamenov等[16]用富含蔗糖食物飼喂OLETF(Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty)大鼠2個月齡后成功誘導出PDN OLETF大鼠模型。研究發現，試驗組動物的血糖和糖化血紅蛋白明顯升高，神經傳導速度(MNCV)和熱痛覺反應明顯降低，疼痛閥值增加。該模型的優點：(1)血糖及糖化血紅蛋白水平明顯升高；(2)運動神經傳導速度和熱傷害感受水平降低。其缺點：(1)PDN的主要機制尚不清楚，模型動物血糖、糖化血紅蛋白水平未見明顯升高，與人類存在較大的差異；(2)尚未被治療PDN的藥物驗證。

1.3 STZ誘導結合手術方法誘導的 PDN模型

1.3.1 神經病變RIP/IFNβ(Rat insulin I promoter/human interferon-beta)轉基因ICR小鼠模型 2010年Serafin A等[17]用低劑量(30 mg/kg體重)的STZ連續5天注射6周齡的RIP/IFNβ轉基因ICR小鼠并輔以左側坐骨神經損傷的方法開發出一種PDN模型。該模型的優點：(1)明顯的高血糖癥，脛骨感覺神經傳導速度明顯變慢；(2)降低神經纖維密度并增加運動延遲反應。其缺點：(1)需要采用復雜的外科方法以及藥物損傷制備該模型；(2)尚未被治療糖尿病藥或PDN的藥物驗證。

1.3.2 STZ誘導的大鼠疼痛模型 1999年Fox等[18]、2003年Kale B等[19]在STZ誘導糖尿病模型基礎上，通過手術分離并結扎坐骨神經使后肢發生潰瘍壞疽，獲得PDN模型，該模型可評價神經干多層次減壓對糖尿病神經病變的療效。該模型的優點：(1)產生持續長時間的機械熱痛覺過敏但不出現熱痛覺過敏；(2)已用于治療PDN的藥物評價。其缺點是主要的發病機制不清楚。

1.4 外科手術法誘導的 PDN模型 2010年Muthuraman等[20]對大鼠股動脈進行缺血-再灌注制備了大鼠血管神經炎模型。研究發現，該模型能降低血清IL - 10和神經傳導速度和增加血清硝酸鹽、丙二醛(MDA)和TNF-α水平；神經纖維密度的減少出現在中度和重度I/R組；溫和的缺血再灌注損傷(4 h) 模型可以用來探索病理生理機制，也可用于評估新的止痛劑、外圍神經血管性物質和神經保護藥物。該模型的優點：(1)爪和尾出現熱/ 機械性痛敏反應；(2)神經纖維密度和神經傳導速度降低；(3)誘導期十分短。其缺點：(1)尚未被治療PDN的藥物驗證；(2)發病機制與人類 PDN發病機制有較大的差異。

1.5 基因修飾動物周圍神經病變模型

1.5.1 PDN遺傳改良的C57BL/Ks (db/db)小鼠模型 2013年 Hinder等[21]敲除db/db或ob/ob小鼠的ApoE和ApoB48基因后建立了血脂異常的PDN模型。該模型的優點：(1)增加動物體重、出現高血糖癥和高脂血癥；(2)降低對熱刺激的尾彈反應，降低坐骨運動神經傳導速度和表皮內神經纖維速度。其局限性：(1)體重、血糖、血漿脂質及糖化血紅蛋白的結果不一致；(2)尚未被治療糖尿病及PDN的藥物驗證。

1.5.2 基因修飾的SDT肥胖大鼠模型 2012年Yamaguchi等[22]通過導入ZDF大鼠(Zucker Diabetic Fatty)的fa等位基因開發出PDN大鼠模型。該模型除了具備持續高血糖癥、脂代謝紊亂外，還能在24周齡時明顯延遲或降低神經傳導速度，在40周齡時明顯降低腓腸神經纖維的數量。此外，該模型還出現硬膜小動脈增厚的癥狀。該模型已用于治療糖尿病的藥物—吡格列酮的評價，它能明顯改善運動神經傳導速度和糖化血紅蛋白水平。因此，該模型對于了解PDN發病機理及篩選和開發治療PDN藥物都是一種比較好的模型。該模型的優點包括：(1)持續高血糖癥和脂代謝紊亂且能延遲和降低運動神經傳導速度；(2)降低腓腸神經纖維數量、硬膜小動脈增厚；(3)成功地用于治療糖尿病藥物(如，吡格列酮)的評價。

2 小結與展望

自20世紀60年代以來，研究人員采用膳食誘導法、化學誘導法、化學誘導結合手術法、單純手術法、基因修飾法等方法在小鼠、大鼠、中國倉鼠、恒河猴等實驗動物上開發出多種PDN模型，但大多數的動物模型尚未被治療糖尿病或治療PDN的藥物驗證。成功的PDN模型應具備以下3個基本特征[23]：(1)應盡可能的模擬人類 PDN發病的主要過程；(2)動物模型應具備糖尿病患者發病的基本特征，如高血糖、高胰島素血癥、胰島素抵抗等，在此基礎上誘發 PDN；(3)模型應該對治療糖尿病或治療PDN的藥物敏感，利于治療 PDN藥物的研發。

迄今為止，有些PDN動物模型(如，STZ誘導的大、小鼠PDN模型)已相對比較成熟，但另一些PDN動物模型(如，中國倉鼠、恒河猴等)研究尚處于起步階段。大多數的遺傳或基因修飾的模型[如，C57BL/Ks (db/db)小鼠、STZ誘導的C57BL6/J 模型和 ddY 小鼠、瘦素缺乏的 (ob/ob) 小鼠、NOD小鼠、WBN/Kob大鼠、自發性糖尿病大鼠模型等] 應用較多的領域為PDN發病機理研究，并且某些動物模型(如，L-海藻誘導的神經病變大鼠、OLETF大鼠、基因修飾的SDT大鼠等)在糖尿病及PDN機理研究及藥物研發方面已顯現出較好的前景[27]，這些模型能準確模擬I型糖尿病引發的PDN，但不能反映人類2型糖尿病并發的PDN[26]，因此，制備出與人類生理病理相似的 PDN模型仍然是該領域研究的熱點，也是研發治療 PDN類藥物急需逾越的一道技術鴻溝。

近年來，隨著國內非人靈長類動物(NHP)飼養行業的發展，國內已擁有世界范圍內最大的NHP動物資源，運用NHP研究人類疾病模型的研究越來越多。非人靈長類動物在生理、病理領域與人類具有高度的相似性，擁有其他動物無法比擬的先天優勢，。雖然目前在 PDN方面的研究尚處于起步階段，但NHP在糖尿病模型的研究中已有較多的報道，而 PDN又是DM的主要并發癥之一，因此，運用NHP進行 PDN的研究將會越來越多，運用該類動物制備的 PDN模型能夠完全符合前述成模的3個基本條件。此外，由于NHP與人類的高度相似性，它還能為治療 PDN類藥物、抗DM類藥物的研發提供十分重要的臨床前信息，現已應用于創新治療方法的測試。

中國現已成為全球最大的靈長類實驗動物資源的供應國，且已有多個研究機構在開展糖尿病靈長類動物模型及其并發癥研究[4、24]。隨著新技術(如，轉基因、基因編輯等)在糖尿病及其并發癥研究中的應用，相信不久的將來，我國在糖尿病其并發癥(如，PDN等)發病機理及創新藥物研究領域也將取得突破性進展。

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