幼齡大鼠環磷酰胺免疫抑制模型中血液學和腸道黏膜免疫指標的觀察

許江城 ， 劉 斌 ， 蔡京美 ， 金孟燮 ， 佘銳萍

(1.中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ; 2.北京韓美藥品有限公司 ， 北京 順義 101312)

免疫抑制動物模型在新藥開發與評價中廣泛使用，現有研究多使用成年動物建模[1-2]。由于幼齡個體與成年個體在藥物代謝和藥效方面不完全一致，使用幼齡動物模型進行研究和評價幼齡個體用藥已經成為共識并得到各國藥物監管機構的推薦。

目前幼齡大鼠免疫抑制模型的相關報道較少。參考成年動物研究[3-5]，觀察本課題組建立的幼齡大鼠環磷酰胺(CYP)免疫抑制模型，探索血液學和腸道黏膜免疫指標變化特點，為模型今后的應用提供更多數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雌性4周齡SD大鼠60只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。飼養在北京韓美藥品有限公司動物房屏障環境內(許可證號：SYXK(京)2015-0013)，試驗經IACUC委員會批準，獨立通風籠架(IVC)飼養，自由采食和飲水。

1.2 儀器和試劑 儀器：SYSMEX XT-2000i血液分析儀，日立7020生化分析儀。試劑：希斯美康血液分析試劑，美康生化分析試劑，PAS染色試劑盒(Sigma公司,395B-1KT)，環磷酰胺單水合物(東京化成工業株式會社)，sIgA一抗(北京博奧森生物技術有限公司，bs-0645R)。

1.3 試驗分組 環磷酰胺免疫抑制模型組隨機選取30只雌性4周齡SD大鼠口服給與環磷酰胺30 mg/kg體重隔1日共2次，剩余30只編入對照組。

1.4 體重和臨床觀察 自第一次給藥起，共觀察14 d。臨床觀察包含死亡數，一般健康狀況和毒性癥狀。每日稱量大鼠體重并記錄(n=10)。

1.5 血液學指標檢測 第2、4、8、15天，測定紅細胞數(RBC)、白細胞總數(WBC)、嗜中性粒細胞數(NEUT)、淋巴細胞數(LYMPH)、嗜酸性粒細胞數(EO)、嗜堿性粒細胞數(BASO)、單核細胞數(MONO)和網織紅細胞數(RET)。

1.6 血清生化指標檢測 4 d時測定丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(T-BIL)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、血清尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(T-CHO)、血清葡萄糖(GLU)。計算得到白球比例(白球比，A/G=白蛋白/球蛋白)和球蛋白(GLO，總蛋白-白蛋白)。

1.7 小腸腸道黏膜免疫指標的檢測 15 d大鼠剖檢取材，計數小腸派氏結(Peyer′s Patch, PP)后中性多聚甲醛固定。腸道石蠟切片H.E.染色后光鏡檢查，記錄5個視野內5根腸絨毛的長度寬度和隱窩深度，100個上皮細胞之間的淋巴細胞(Intraepithelial lymphocyte, IEL)數。PAS染色記錄不同腸段內5根絨毛內100個上皮細胞之間的杯狀細胞(Goblet cell，gc)數。sIgA免疫組化染色記錄5個視野內分泌型免疫球蛋白A(secretory IgA))陽性區域面積。

1.8 數據采用x±s表示，使用GraphPad PRISM?6.0版本軟件進行數據間差異顯著性分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體重變化與臨床表現 試驗期間模型組大鼠未見死亡與異常表現。對照組大鼠體重增加(105.8±6.0，205.5±16.9 g：d1，d14)，模型組大鼠體重雖增加但增長緩慢(106.7±4.5，171.4±8.9 g：d1，d14)。自4 d起體重與對照組相比顯著下降(P<0.05)，4 d降幅15%而14 d降幅17%。

2.2 血液學指標的變化 如表1所示，4周齡大鼠與對照組相比多項血液學指標顯著下降(P<0.05)，但變化趨勢各有特點。白細胞總數降幅最高為第8天(81%)，第15天時部分恢復。嗜中性粒細胞數降幅最高為第8天(82%)，第15天恢復并增加16%。淋巴細胞降幅最高為第8天(84%)，第15天時仍降低35%。單核細胞第4天時為最大降幅(96%)，第8天是恢復至正常水平，第15天時升高62%。紅細胞僅8天時顯著降低，第15天恢復，網織紅細胞第4天是最低，第15天時超過對照組水平。

表1 模型中幼齡大鼠血液學指標的變化

注：Con(對照組)，CYP(環磷酰胺模型組)。*：P<0.05，模型組與當日對照組相比

2.3 血清生化指標的變化 如表2所示，4周齡大鼠第4天時血清球蛋白與對照組相比顯著降低(P<0.05)。肝功(ALT，AST，ALP，A/G，T-BIL)、腎功(CREA，BUN)、心肌(CK，LDH)、代謝(TG，T-CHO，GLU)相關指標均在機體正常范圍內且無病理變化。

2.4 小腸腸道黏膜免疫指標變化 如圖1所示，小腸段PP數量與對照組相比顯著下降(P<0.05)，上皮內淋巴細胞數量顯著降低(P<0.05)，杯狀細胞數量顯著降低(P<0.05)。如中插彩版圖2所示腸道sIgA陽性面積降低，腸道sIgA分泌量減少。腸絨毛發育指標中腸絨毛高度、絨毛寬度及隱窩深度與對照組相比無明顯影響，與對照組均無明顯差異。

表2 模型中幼齡大鼠血清生化指標變化

注：Con(對照組)，CYP(環磷酰胺模型組)。*：P<0.05，模型組與當日對照組相比

圖1 幼齡大鼠腸道黏膜免疫指標的變化

A：PP數量顯著下降； B：IEL數量顯著降低； C：gc數量顯著降低。

*：P<0.05， **：P<0.01，模型組與對照組相比

3 討論

環磷酰胺是一種無活性的前藥，在體內代謝后發揮細胞毒性作用。免疫抑制作用多表現為生長抑制，外周血細胞數量減少，免疫器官萎縮，免疫細胞功能抑制等[1,4-6]。環磷酰胺造成的免疫抑制在成年動物模型中已有眾多報道，而使用幼齡大鼠建立的免疫抑制模型和其免疫抑制特點研究還非常缺乏。此階段動物建立的模型適用于評價低年齡段個體的用藥情況。

SD大鼠在4周齡時正處于一個非常快速的生長發育階段，除體重增長明顯外白細胞數量也較高[7]。本試驗發現4周齡幼齡雌性大鼠在CYP免疫抑制模型中表現出以下變化特點：大鼠生長發育抑制，外周血中白細胞總數、嗜中性粒細胞數與淋巴細胞數和單核細胞數顯著減少。其中淋巴細胞恢復速度最慢，單核細胞回升最快并代償性增高超過對照組水平。血清GLO降低說明抗體水平下降。模型中，固有免疫水平和獲得性免疫水平均受到抑制。固有免疫水平在15 d時恢復程度較獲得性免疫高。

圖2 杯狀細胞與分泌型IgA的變化

▲： 杯狀細胞 ； ●：sIgA免疫組化陽性顆粒A： 對照組gc ； B： CYP模型組gc數量降低 ； C： 對照組sIgA陽性區域 ； D： CYP模型組sIgA陽性區域面積減少

腸黏膜免疫屏障是機體防御系統重要組成部分，有研究報道CYP可以引起成年大鼠PP以及gc數量減少[8-9]，本試驗發現幼齡動物的表現與成年動物相類似。在PP、gc顯著減少的同時，IEL數量與sIgA的量也較對照組顯著下降。證明腸道黏膜免疫水平如同外周血細胞一樣也受到CYP較強的抑制作用。而小腸絨毛的發育(長度、寬度和隱窩深度)則未見顯著影響。

綜上所述，4周齡雌性SD大鼠在模型中表現出顯著的生長遲緩與血液固有免疫水平和獲得性免疫水平降低，而未見其他毒性和副作用。其中白細胞及其分類細胞數量和PP數量變化顯著、檢測便捷、免疫抑制相關性高，推薦在模型使用中優先選擇。幼齡大鼠免疫抑制后的變化特點，為模型在低齡兒童或動物藥品、保健食品、化妝品、農藥等研發或評估中的應用提供數據支持。

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