應用多重Taqman-LNA熒光PCR同時檢測肉制品中豬雞鴨源性成分

許如蘇 ， 紀玲珍 ， 黃 帥 ， 周廣彪 ， 魏 霜 ， 段建發

(汕頭出入境檢驗檢疫局，廣東 汕頭 515031)

盡管在2013年歐洲馬肉丑聞之后，我國相關部門開展了打擊肉制品摻假整治活動，但由于不同肉種存在明顯的物價差異，利益的驅使導致肉制品“摻假使假”現象難以杜絕，肉制品摻假時有報道，常見以豬肉、鴨肉等低價肉摻入甚至代替高價的牛羊肉[1-2]，并出現多肉種摻假趨勢[3]。打擊肉制品摻假工作任重而道遠。

基于蛋白質的ELISA方法和基于核苷酸序列的分子生物學方法是肉種鑒別的主要方法。其中，具有穩定、準確、快速等優勢的PCR技術已得到廣泛的應用[4-6]，有的已成為肉種鑒別的標準方法[7-9]，但除了SN/T 2051-2008[8]等少數標準方法采用雙重實時PCR方法同時檢測不同肉種外，SN/T 2727-2010等多數標準[7、9-10]均為單一肉種檢測方法，顯然，現行標準方法尚難以滿足肉制品打假的高通量快速鑒別需要。

本研究針對常見摻假肉種豬、雞、鴨，利用Taqman-LNA熒光探針可提升Tm值，增加探針雜交的特異性[11]和設計靈活性[12]等優點，克服多重熒光PCR普通存在的不同目標序列擴增效率不一致等問題，建立了可同時檢測上述3種肉源性成分的多重熒光PCR方法，達到了快速、經濟、高效的檢測目的。

1 材料與方法

1.1 樣品 從農貿市場、飲食店和超市購買牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、兔等動物肌肉和牛肉丸、牛肉粒、牛肉片、羊肉串、羊肉丸、羊肉片、肉腸等肉制品。

1.2 主要儀器與試劑 熒光定量PCR儀(BIO-RAD， CFX96)，樣品破碎系統(北京格瑞德曼儀器設備有限公司，GT200)；Probes Master 2×conc.(Roche公司)；核酸提取(離心柱法)試劑盒(達安公司)。

1.3 樣品制備和DNA提取 稱取樣品10 g，剪碎后按1∶4加入去離子水，制成肉漿，取50 μL按核酸提取試劑盒說明書提取DNA。

1.4 引物探針的設計與合成標記 從GenBank上查找并下載豬、雞、鴨線粒體基因組全序列，參考近年文獻發表的相關序列，使用ClustalX軟件進行序列比對，篩選出種屬相關的保守序列，使用Primer Express軟件設計引物探針，交上海輝睿生物科技有限公司合成。序列見表1。

表1 引物探針序列

1.5 多重Taqman-LNA熒光PCR方法的建立 按常規方法分別建立檢測豬雞鴨的單重Taqman-LNA熒光PCR方法。在此基礎上組建多重方法，通過優化各引物探針濃度和退火溫度，驗證方法的特異性和檢測限，最后確定多重方法的反應體系為20 μL，其中Probes Master 2x conc溶液10μL，豬、雞、鴨的引物終濃度分別為0.6 μmol/L、0.3 μmol/L、0.8 μmol/L，探針終濃度分別為0.3 μmol/L、0.1 μmol/L、0.4μmol/L，DNA模板2 μL。反應條件為95 ℃ 8 min；95 ℃ 8 s，59 ℃ 25 s，40個循環。

1.6 對市售肉制品的檢測及陽性結果的驗證 用多重方法對市售肉制品進行檢測，同時采用SN/T 2051-2008，SN/T 2978-2011和SN/T 3731.5-2013對檢出動物源性成分與標簽不符樣品進行檢測驗證。

2 結果

2.1 特異性試驗 與從牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、驢、兔等動物肌肉提取的DNA的試驗結果，相應熒光通道僅與對應的肉種出現特異性擴增，與其他肉種無典型擴增。

擴增產物經送上海輝睿生物科技有限公司測序，結果與預期相符。

2.2 敏感性試驗 多重方法對豬、雞、鴨的檢測限均達到肉含量的0.001%。結果見表2。擴增曲線和標準曲線詳見圖1。

表2 多重Taqman-LNA熒光PCR方法敏感性試驗結果

注：*敏感性試驗為3次重復試驗；**3次重復Ct<35，且有典型擴增曲線

圖1 多重Taqman-LNA熒光PCR敏感試驗擴增曲線及標準曲線

注：擴增曲線從左到右分別為肉含量100%～0.0001%。平線為陰性對照

2.3 對市售樣品的檢測結果及對陽性結果的驗證 共檢測市售樣品170份，檢出標簽標示以外肉種成分的樣品共42份，其中豬肉和鴨肉各19份，同時檢出豬、雞、鴨肉2份，詳見表2。樣品不合格率為24.7%。從表2可看出，豬肉和鴨肉是主要的摻假肉種，從肉種看，摻假頻率較高的樣品為牛羊肉制品；從加工方式看，摻假頻率較高的樣品為丸類制品和調味較重的肉制品。

對檢出肉種成分不符的42份樣品，分別采用SN/T 2051-2008 ，SN/T 2978-2011 和SN/T 3731.5-2013對其中的豬、雞、鴨源性成分進行檢驗確證，結果除1份香酥牛肉丁和1份麻辣牛肉未檢出鴨源性成分，與多重方法檢測結果不符外，其余檢驗結果與多重方法一致，多重方法的檢測結果與標準方法的符合率為95.5%。

表2 市售肉制品檢測結果

3 討論

本試驗建立的多重Taqman-LNA熒光PCR方法能同時檢測肉制品中的豬、雞、鴨源性成分，具有良好的特異性和敏感性，多成分同步檢測既節約試劑、耗材，降低檢測成本，又節省時間，快速便捷。與何瑋玲等[13]應用多重 PCR 同時鑒定豬、牛、羊、雞相比，操作更簡便，也更快速安全，既無需電泳和觸毒，還可免去對擴增產物的測序證實。與現行標準方法相比，本多重方法顯著提高了檢測效率和檢測通量，可滿足打擊肉制品摻假執法的需要。

關于動物源性成分的鑒別已有很多研究報道，其中，Taqman-LNA熒光PCR方法以穩定、準確、快速、無需觸毒等優勢而得到越來越廣泛的應用，然而，在探針設計時，需要通過較長的探針序列來獲得較高的Tm值，在設計多重反應時，常常會因此難以找到理想的探針序列。Taqman-LNA熒光探針是在Taqman探針的基礎上，有目的地將探針的一些堿基修飾成LNA堿基，通過提高探針的Tm值，縮短探針長度來增加探針的穩定性、特異性和設計的靈活性[14]。本試驗利用Taqman-LNA探針的上述優點，設計了序列較短，但特異性較強的Taqman-LNA探針，實現了多肉種同步檢測。

以往的熒光PCR儀如Roche，LightCycler?480，由于相鄰熒光通道存在一定波長的交叉而產生相互熒光干擾，雖然通過建立顏色補償曲線等技術處理，可在一定程度上消除相鄰通道的熒光干擾，但遇到弱反應時，效果可能不盡理想，加上增加了操作步驟和試劑耗材，使多重熒光PCR的應用受到了制約。本試驗采用新一代的熒光PCR儀BIO-RAD， CFX96，由于相鄰通道沒有波長交叉，因此，進行多重反應時不會產生熒光干擾，無需任何技術處理，其檢測限與單重反應沒有明顯區別。

對市售肉制品檢測發現，肉制品摻假依然存在，比例尚不低，甚至某大品牌企業也參與其中。雖然以低價肉代替高價肉的安全風險不高，但存在欺詐行為。一些企業鉆了標簽標準和目前肉制品中肉含量尚無定量檢測標準的空子，利用肉制品的多肉種成分，以高價肉作為品名，而實際卻以低價肉為主打肉，這應引起監管部門和標準制定者的關注，建議在對標簽標準修訂時，應明確標簽列明肉含量，并僅限以主肉種作為品名。而檢驗檢測機構應加快肉制品中肉含量的定量檢測研究，盡快制定肉含量定量檢測標準。

[1] 郭鳳柳，熊蕊，劉曉慧，等.應用PCR技術檢測摻假肉類[J].食品安全質量檢測學報，2014,5(2)：541-545.

[2] 許如蘇,周廣彪，魏霜，等.鎖核酸探針技術快速檢測鴨源性成分的研究[J].中國獸醫雜志，2015，51(9)：91-93。

[3] 吳國頌. 珠海6家農貿市場"肥羊"摻假 鴨肉馬肉湊數[EB/OL]. http://www.chinadaily.com.cn/hqgj/jryw/ 2014-01-13/content_11021566.html.

[4] Tanabe S, Hase M, Yano T,etal. A real-time quantitative PCR detection method for pork, chicken, beef, mutton, and horseflesh in foods[J]. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2007, 71(12): 3 131-3 135.

[5] Chisholm J, Conyers C, Booth C,etal. The detection of horse and donkey using real-time PCR[J]. Meat Science, 2005, 70(4): 727-732.

[6] Chun-Lai Zhang,Mark R.Fowler, Nigel W,etal. Scott a taqman real time PCR system for the identification and quantification of bovine DNA in meats,milks and cheeses[J]. Food Control, 2007,18:1 149-1 158.

[7] SN/T 3731.5-2013 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分:鴨成分檢測 PCR法[S].

[8] SN/T 2051-2008 食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法 實時PCR法[S].

[9] SN/T 2978-2011 動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法[S].

[10] SN/T 2727-2010 飼料中禽源性成分檢測方法 實時熒光PCR方法[S].

[11] 王清，倫立民，王麗華，等.Taqman鎖核酸探針實時熒光定量PCR檢測乙型肝炎病毒DNA[C]. 青島：青島市分析測試學會，2011-2-22.

[12] 李生茂，徐祥，梁華平，等.鎖核酸研究進展[J].生理科學進展, 2003,34(4): 319-323.

[13] 何瑋玲，張馳，楊靜，等.食品中4種肉類成分多重PCR的快速鑒別方法[J].中國農業科學，2012,45(9)：1 873-1 880.

[14] 許如蘇，周廣彪，段建發，等.Taqman-LNA熒光PCR快速檢測肉制品中馬源性成分的研究[J].中國動物檢疫,2015，32(7)：62-66.