低氧預處理降低大鼠癲癇易感性及其腦保護作用的機制初探

高 晨，田立樁，朱文霞，白 潔，王瑞娟，高菱宜，趙 靜

(1.蘭州軍區蘭州總醫院安寧分院，蘭州 730070;2.蘭州軍區蘭州總醫院，蘭州 730050)

低氧預處理降低大鼠癲癇易感性及其腦保護作用的機制初探

高 晨1，田立樁2，朱文霞1，白 潔1，王瑞娟1，高菱宜1，趙 靜1

(1.蘭州軍區蘭州總醫院安寧分院，蘭州 730070;2.蘭州軍區蘭州總醫院，蘭州 730050)

目的初步探討間斷低氧預處理(intermittent hypoxia preconditioning，IHP)對氯化鋰-匹魯卡品(lithium-pilocarpine，Li-pilo)致癇大鼠癇性發作的影響及其腦保護作用機制。方法96只清潔級 SD大鼠，隨機均分為對照組，癲癇組和4個間斷低氧預處理+癲癇組。癲癇組及4個間斷低氧預處理+癲癇組(分別在5 d IHP預處理后1，3，7，14日注射)大鼠通過腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品建立癲癇模型。隨后進行240 min的發作行為學，全身性發作潛伏期及百分比量化分析并通過水迷宮實驗測試大鼠認知功能。接著利用TUNEL標記和免疫印跡方法進行大鼠海馬神經元凋亡及相關蛋白(BCL-2，Bax和cleaved-caspase-3)的檢測。結果氯化鋰-匹魯卡品注射后50～150 min之間，癲癇發作的改良 Racine評分達到峰值。間斷低氧預處理后3日誘發癲癇組大鼠其平均改良Racine評分明顯低于其余各組，該組全身性發作潛伏期及百分比與癲癇組相比差異亦有統計學意義(P＜0.05)。相比癲癇組和其余3個間斷低氧預處理+癲癇組大鼠，間斷低氧預處理后3日誘發癲癇組大鼠逃避潛伏期(escape latency)較短，神經元凋亡計數較低，而目標象限停留時間百分比較高(P＜0.05)。間斷低氧預處理后3日誘發癲癇組的水迷宮以及凋亡檢測參數與對照組相比較無明顯差異(P＞0.05)。結論IHP預處理通過抑制異常凋亡降低大鼠癲癇易感性，并具有腦保護作用。

低氧預處理;癲癇;腦保護;大鼠

接近且低于細胞損傷閾值的多種有害刺激誘導機體產生適應性以保護器官對抗后續的同種(耐受)或不同種(交叉耐受)損傷刺激，這一機體的內生性保護機制已成為腦保護研究熱點［1］。研究表明癲癇預處理通過交叉耐受保護大腦抵抗缺血/缺氧損傷［2］。本研究通過 IHP預處理后藥物致癇大鼠癲癇易感性的實驗觀察以及海馬神經元凋亡檢測，初步探討適度低氧對癲癇的影響及其腦保護機制，為相關疾病新的治療方案奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級8周齡雄性SD大鼠96只，蘭州大學醫學實驗動物中心提供【SCXK(甘)2014-0016】，體重200～250 g，常規分籠飼養。動物實驗經蘭州軍區蘭州總醫院倫理委員會書面同意，具備動物實驗資格【SYXK(軍)2014-022】。動物隨機分為6組(每組16只):對照組(control;始終正常飼養)，癲癇組(seizure;制作Li-pilo癲癇模型)和4個間斷低氧預處理+癲癇組(IHP-seizure，分別在 IHP預處理后第1，3，7，14日制作Li-pilo癲癇模型)。

氯化鋰(Q2084)和匹魯卡品(P6503)購自美國Sigma公司。TUNEL凋亡檢測試劑盒(QIA33)購自美國 Merck Millipore公司。Cleaved-caspase-3單抗(#9664)，Bax多抗(#2772)和 α-tubulin(#2144)購自美國 Cell Signaling Technology公司。Bcl-2(N-19)多抗(sc-492)購自Santa Cruz上海分公司。辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(ab136817)購自美國Abcam公司。

1.2 大鼠IHP預處理

大鼠被分組置于密閉的預處理有機玻璃盒子(70×40×20)cm3中，盒內溫度維持在22～25°C。自充氣口向盒內充入低氧混合氣體(9%O2+91% N2)，流量4 L/min，每日90 min，連續5 d。對照組及癲癇組大鼠也間斷置于盒子中飼養，但不密閉隔絕空氣。

1.3 大鼠Li-pilo癲癇模型制作

大鼠先行腹腔注射氯化鋰(125 mg/kg)，18～24 h后再次腹腔注射匹魯卡品(20 mg/kg)。在匹魯卡品注射前30 min，以1 mg/kg劑量腹腔注射東莨菪堿可以減輕其膽堿能副作用。對照組大鼠腹腔注射氯化鋰，18～24 h后以等容量生理鹽水代替匹魯卡品腹腔注射。

1.4 癲癇模型的行為學觀察及量化分析

癲癇組及IHP-癲癇組各組隨機選取8只進行行為學視頻監測，持續240 min。依據改良 Racine評分法［3］對監測視頻每5 min進行1次評分，每只大鼠48個評分點。具體評分標準如下:0級，靜止不動，立毛，興奮和快速呼吸;1級，嘴部活動，唇舌和觸須，流涎;2級，頭和眼陣攣;3級，前肢陣攣，濕狗樣顫栗;4級，陣攣性直立;5級，陣攣性直立合并姿勢失控及不自控的跳躍。另外計算癲癇大鼠藥物注射后達到改良 Racine 4級(即全身性發作)的平均潛伏期以及48個評分點達到全身性發作(改良Racine 4，5級)的百分比。

1.5 水迷宮實驗

各組剩余8只大鼠進行Morris水迷宮實驗。以定位航行實驗測試大鼠的認知學習能力。將大鼠隨機放入圓形泳池等分的4個象限內自由游動，直至尋找并爬上水中平臺。如在1 min內大鼠找到平臺，逃避潛伏期即為尋找平臺實際時間。如1 min內找不到平臺，逃避潛伏期記為60 s。計算每日2次8個象限的平均逃避潛伏期。連續進行5 d實驗。

以空間探索實驗測試大鼠的記憶能力。在定位航行實驗的第1日和第5日測試后進行空間探索試驗。撤除平臺后將大鼠從平臺所在對側象限中點放入水中，計算120 s內大鼠在平臺象限平均停留的時間百分比。

1.6 鼠腦免疫組化切片制備

各組隨機選取8只大鼠在水合氯醛麻醉下經心臟灌流處死，斷頭取腦。4%多聚甲醛固定24 h，蔗糖PB溶液階梯脫水48 h。包埋后連續冰凍切片(厚度6 μm)。

1.7 原位末端脫氧核苷酸轉移酶介導生物素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標記(TUNEL)凋亡檢測(顯色法)

每組隨機選8張鼠腦切片，順序滴加蛋白酶K工作液(90 min)，3%H2O2甲醇溶液(5 min)，TdT平衡緩沖液(30 min)，均室溫孵育。滴加60 μL TdT標記反應混合物，37°C避光濕盒內孵育90 min。滴加終止液室溫孵育5 min。隨后順序滴加封閉緩沖液(10 min)，偶聯物(30 min)以及3，3-二氨基聯苯胺(DAB)工作液(10～15 min)，均室溫孵育，甲基綠復染 3 min，顯微鏡明場條件下觀察并拍照。Images J軟件圖像分析，每組切片隨機選擇海馬CA1區10個不同的高倍視野(×200)計數陽性細胞數，取平均值。

1.8 免疫印跡(Western blot)凋亡相關因子及蛋白檢測

各組剩余大鼠在水合氯醛麻醉下直接斷頭處死。取海馬組織勻漿后裂解，提取總蛋白，BCA法測定濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)每孔上樣蛋白總量為20 μg，時間120 min。350 mA恒流帶電轉膜(120 min)，5%牛血清白蛋白室溫震蕩封閉 1 h，5%脫脂奶粉稀釋后分別加入一抗(BCL-2，Bax，cleaved-caspase-3，1∶1000)，以 αtubulin(1∶1000)作為內參，4°C孵育過夜。1∶5000稀釋的HRP二抗在室溫下震蕩孵育2 h。滴加發光檢測液在凝膠成像系統中拍照。Image J軟件灰度量化分析，重復3次實驗取平均值。

1.9 統計學方法

本研究數據資料采用SPSS 13.0統計軟件包進行分析。計量資料采用均數±標準差(±s)表示。不同組樣本均數間的兩兩比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。根據各組總體方差齊同與否，選擇Bonferroni法或Tamhane’s T2法修正結果，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癲癇模型大鼠視頻行為學表現及量化分析

各組8只視頻監測癲癇大鼠48個時間點改良Racine評分均值折線圖如圖1所示。急性期發作峰值在匹魯卡品注射后50-150 min之間。IHP-1d癲癇組，IHP-3d癲癇組和 IHP-7d癲癇組平均改良Racine評分均低于癲癇組(P＜0.05)，而IHP-3d癲癇組則明顯低于其余各組(P＜0.05)。IHP-14d癲癇組發作表現與癲癇組基本相似(P＞0.05)。

各組大鼠全身性發作平均潛伏期，如表1所示。IHP-3d癲癇組潛伏期最長為76.88±20.90 min，與其余各組均有明顯區別(P＜0.05)。癲癇組潛伏期最短為21.64±2.22 min，與IHP-3d癲癇組和IHP-7d癲癇組(36.73±4.50 min)有明顯區別(P＜0.05)，與IHP-1d癲癇組(25.64±4.10 min)組及IHP-14d癲癇組(24.65±3.89 min)比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

各組大鼠全身性發作百分比，如表2所示。癲癇組最高為 41.94±16.34%，與 IHP-1d癲癇組(31.79±9.17%)，IHP-3d癲癇組(11.13±4.72%)，IHP-7d癲癇組(29.77±7.76%)之間差異具有統計學意義(P＜0.05)。IHP-3d癲癇組明顯低于其余各組(P＜0.05)。IHP-14d癲癇組(38.56± 13.53%)與癲癇組無顯著差異(P＞0.05)。

表1 各組癲癇大鼠全身性發作潛伏期(單位:min，n=8)Tab.1 Latency of generalized seizure in epileptic rats from all groups(Unit:min，n=8 per group)

表2 各組癲癇大鼠全身性發作評分時間點百分比(單位:%，n=8)Tab.2 Percentage of generalized seizure time points in epileptic rats from all groups(Unit:%，n=8 per group)

2.2 癲癇模型大鼠認知和記憶能力評估結果

如圖2A所示，定位航行實驗中，癲癇組逃避潛伏期明顯長于對照組、IHP-1d癲癇組、IHP-3d癲癇組和IHP-7d癲癇組(P＜0.05)，與IHP-14d癲癇組無明顯差異(P＞0.05)。IHP-3d癲癇組則與對照組無明顯差異(P＞0.05)。如圖2B所示，空間探索實驗結果表明癲癇組大鼠在目標象限停留時間明顯短于其余各組(P＜0.05)，而IHP-3d癲癇組與對照組無明顯差異(P＞0.05)。

2.3 鼠腦海馬CA1區神經元凋亡情況

各組大鼠海馬CA1區神經元凋亡情況，如圖3所示。同一倍數視野下，癲癇組大鼠海馬神經元平均凋亡計數高達 69.3±12.8 cells/HP，與對照組(15.5±6.8 cells/HP)，IHP-1d癲癇組(26.3±7.2 cells/HP)，IHP-3d癲癇組(18.7±9.6 cells/HP)及IHP-7d癲癇組(30.8±10.6 cells/HP)均有明顯差異(P＜0.05)。IHP-14d癲癇組(61.0±8.4 cells/ HP)與癲癇組無明顯差異(P＞0.05)。相反，IHP-3d癲癇組凋亡計數與對照組及IHP-1d癲癇組相比較無明顯差異(P＞0.05)，明顯低于其余各組(P＜0.05)。

2.4 鼠腦海馬組織凋亡相關因子及蛋白檢測情況

免疫印跡檢測如圖4所示，對照組大鼠海馬組織 BCL-2，Bax及 cleaved-caspase-3均有少量正常表達。癲癇組大鼠 Bax及 cleaved-caspase-3表達明顯升高，BCL-2明顯降低，與IHP-14d癲癇組以外的其余各組均有明顯差異(P＜0.05)。IHP-3d癲癇組的上述指標與對照組無統計學差異(P＞0.05)與其余各組之間均有明顯差異(P＜0.05)。

綜上所述，IHP預處理后大鼠癲癇易感性降低，發作后認知和記憶能力損害減輕。在細胞及分子水平神經元凋亡檢測顯示IHP預處理的保護作用在第3天達到最佳效果，14 d后保護作用基本消失。

圖1 癲癇大鼠模型改良Racine評分情況Note.*P＜0.05 versus the seizure group，#P＜0.05 versus IHP 3d seizure group，ANOVA with post hoc Bonferroni correction，n=8 per group.Fig.1 The scoring results rated with modified Racine Scale of epileptic rat models in all groups

3 討論

癲癇嚴重威脅人類健康，近年來機體內生性神經保護機制已成為抗癲癇研究的關注熱點。研究表明各類物理或化學性的低于細胞損傷閾值的傷害性刺激所誘導的耐受效應具有器官普遍性［4］和交叉性［2］。本研究證實輕度缺氧交叉誘導癲癇之間存在“交叉耐受”，IHP預處理降低實驗大鼠癲癇易感性的同時減輕其認知及記憶功能損害。癲癇導致認知功能障的始作俑者是發作過程中缺血/缺氧造成的海馬神經元損傷。海馬與認知功能密切相關［5］，而海馬解剖、病理變化所帶來的細胞分子生物學改變則與癲癇發病機制密切相關。因此本研究進一步引入了海馬神經細胞凋亡檢測以初步探討癇性腦損傷及IHP預處理腦保護機制。細胞凋亡調控的多種蛋白因子中 Bcl-2和 Bax尤為重要，前者阻止凋亡，后者則促進凋亡［6］。Bcl-2/Bax含量比下降激活下游caspase蛋白家族的瀑布式反應，最后通過 caspase-3產生細胞凋亡［7］，后者在凋亡執行階段，負責關鍵性蛋白的酶切。海馬神經元絕對數量減少以及神經纖維變性，造成神經軸突出芽和突觸重塑，形成了反復異常的興奮點，造成大腦興奮性和抑制性網絡失衡，進而導致癲癇發作［8］。本研究結果表明，癲癇大鼠海馬神經元出現了以凋亡失調為主要特征的病理損害，促凋亡因子升高，凋亡抑制因子下調，最終導致神經元大量丟失。IHP預處理逆轉了上述病理過程，大鼠癲癇易感性隨之降低，功能性腦損傷亦明顯減輕。

圖2 各組大鼠認知和記憶能力評估Note.*P＜0.05，versus the seizure group，#P＜0.05，versus the IHP 3d seizure group. ANOVA with post hoc Tamhane’s T2 correction，n=8 per group.Fig.2 Evaluation of the cognition and memory ability in rats from all groups

圖3 各組大鼠海馬CA1區TUNEL顯色法染色情況(×200)Fig.3 The TUNEL labeling of hippocampal CA1 region in the rats from all groups(Bar=50 μm)

圖4 各組大鼠海馬凋亡相關因子及蛋白檢測情況Note.*P＜0.05 versus the seizure group，#P＜0.05 versus the IHP 3d seizure group，ANOVA with post hoc Tamhane’s T2 correction，n=8 per group.Fig.4 Detection of apoptosis-related factors and proteins in the rat hippocampus from all groups

神經元正常生理功能的實現依賴于膠質細胞對其能量代謝的維護［9］。星形膠質細胞-神經元乳酸穿梭(astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis，ANLSH)理論詮釋了二者能量代謝上聯系的重要性。神經興奮性和癲癇發作與快速葡萄糖利用及糖酵解相關，腦能量代謝從葡萄糖利用轉變為缺氧狀態下的乳酸及酮體利用，通過復雜集成系統降低神經興奮性增強抑制性，表明癲癇起病與腦能量內穩態改變相關［10］，而維護大腦自穩態是星形膠質細胞最重要的生理功能［11］。高壓氧治療過程中氧化一氮將增加癲癇易感性［12］，進一步反證缺血/缺氧對癲癇的抑制作用。因此，我們認為IHP預處理所誘導的癲癇耐受正是通過星形膠質細胞對神經元能量代謝的維護而得以實現的。IHP預處理后3d為最佳保護期，隨后保護效果逐漸減退，考慮系預處理激活的內生性保護因子經過機體代謝逐漸消失所致。

ANLSH依賴于單羧酸轉運體(monocarboxylate transporters，MCTs)對乳酸調控［13］。MCT4是低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)的靶基因之一［14］。后者通過調控靶基因對缺血/缺氧及時應答以保持體內氧平衡［15］。缺血/缺氧與癲癇之間交叉耐受系多種低氧及神經興奮性效應分子共同作用的結果。針對這些保護因素的深入研究將為開發新的診療手段提供重要的理論支撐。

［1］Dirnagl U，Becker K，Meisel A.Preconditioning and tolerance against cerebral ischemia:from experimental strategies to clinical use［J］.Lancet Neurol，2009，8(4):398-412.

［2］Plamondon H，Blondeau N，Heurteaux C，et al.Mutually protective actions of kainic acid epileptic preconditioning and sublethalglobalischemia on hippocampalneuronaldeath: involvement of adenosine A1 receptors and K(ATP)channels［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1999，19(12):1296-1308.

［3］Medina-Ceja L，Sandoval-Garcia F，Morales-Villagran A，et al. Rapid compensatory changes in the expression of EAAT-3 and GAT-1 transporters during seizures in cells of the CA1 and dentate gyrus［J］.J Biomed Sci，2012，19:78.

［4］Sharp FR，Ran R，Lu A，et al.Hypoxic preconditioning protects against ischemic brain injury［J］.NeuroRx，2004，1(1):26-35.

［5］Titiz AS，Mahoney JM，Testorf ME，et al.Cognitive impairment in temporal lobe epilepsy:Role of online and offline processing of single cell information［J］.Hippocampus，2014，24(9):1129 -1145.

［6］Cory S，Adams JM.Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/ Bax switch［J］.Cancer Cell，2005，8(1):5-6.

［7］Mehmet H.Caspases find a new place to hide［J］.Nature，2000，403(6765):29-30.

［8］SloviterRS. Progress on the issue of excitototic injury modification vs realneuroprotection: implications forposttraumatic epilepsy［J］.Neuropharmacology，2011，61(5-6): 1048-1050.

［9］Araque A，Perea G.Glial modulation of synaptic transmission in culture［J］.Glia，2004，47(3):241-248.

［10］Hartman AL.Does the effectiveness of the ketogenic diet in different epilepsies yield insights into its mechanisms?［J］. Epilepsia，2008，49(Suppl 8):53-56.

［11］Lauritzen F，Perez EL，Melillo ER，et al.Altered expression of brain monocarboxylate transporter 1 in models of temporal lobe epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2012，45(1):165-176.

［12］Liu W，Li J，Sun X，et al.Repetitive hyperbaric oxygen exposures enhance sensitivity to convulsion by upregulation of eNOS and nNOS［J］.Brain Res，2008，1201:128-134.

［13］Simpson IA，Carruthers A，Vannucci SJ.Supply and demand in cerebral energy metabolism:the role of nutrient transporters［J］. J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(11):1766-1791.

［14］Rademakers SE，Lok J，van der Kogel AJ，et al.Metabolic markers in relation to hypoxia; staining patterns and colocalization of pimonidazole，HIF-1alpha，CAIX，LDH-5，GLUT-1，MCT1 and MCT4［J］.BMC Cancer，2011，11:167.

［15］Majmundar AJ，Wong WJ，Simon MC.Hypoxia-inducible factors and the response to hypoxic stress［J］.Mol Cell，2010，40 (2):294-309.

Preliminary study on the role of hypoxia preconditioning in decreasing the susceptibility to epilepsy and brain protection in rats

GAO Chen1，TIAN Li-zhuang2，ZHU Wen-xia1，BAI Jie1，WANG Rui-juan1，GAO Ling-yi1，ZHAO Jing1
(1.AnNing Branch Hospital，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region，Lanzhou 730070，China. 2.Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Region，Lanzhou 730050.)

ObjectiveTo preliminarily explore the effects and brain protective mechanism of intermittent hypoxia preconditioning(IHP)on rats with seizures induced by lithium-pilocarpine(Li-pilo).MethodsA total of 96 8-week old male Sprague Dawley rats(clean grade)were randomly divided into control group，seizure group and four IHP-seizure groups.The animal model of epilepsy was established by intraperitoneal injection of Li-pilo in the seizure group and four IHP-seizure groups(Li-pilo was injected at 1，3，7，or 14 days after a 5-day regimen of IHP).Subsequent seizure behavior，the latency period and percentage of generalized seizures were quantitatively evaluated for 240 min and the cognitive function was tested by Morris water maze task，and followed by the detection of hippocampus neuron apoptosis and related protein(BCL-2，Bax，and cleaved-caspase-3)by TUNEL labeling and Western blot，respectively.ResultsTheinduced seizure peaked on an average between 50-150 min after Li-pilo administration，scored using a modified Racine scale.The average scores of modified Racine scale in the IHP-3d seizure group was significantly lower than that in the other groups.The latency period and percentage of generalized seizures in the IHP-3d seizure group rats were significantly different from the parameters in the seizure group rats(P＜0.05).IHP-3d seizure rats showed lower escape latency，neuronal apoptosis counts and higher percentage of time in the probe quadrant compare with the seizure group and the other three IHP-seizure groups(P＜0.05).Compared with the control group，the parameters of water maze and apoptosis detection in the IHP-3d seizure group showed no significant changes(P＞0.05).ConclusionsThe results indicate that IHP treatment may help to decrease the susceptibility to epilepsy by reducing abnormal apoptosis，and has a brain protective effect on the seizure rats.

Hypoxia preconditioning;Epilepsy;Brain protection;Rat

R-33

A

1671-7856(2016)12-0032-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.007

2016-07-01

高晨(1977-)，男，醫學博士，主治醫師。研究方向:功能神經外科的基礎與臨床研究。Email:gc2006418@163.com。