聚合酶鏈反應在貓幾種病毒診斷中的應用

(吉林農業大學生命科學學院，吉林長春130118)

聚合酶鏈反應在貓幾種病毒診斷中的應用

杜翔宇，孫英堯，楊一鳴，董浩

(吉林農業大學生命科學學院，吉林長春130118)

本文以聚合酶鏈反應檢測技術的理論與應用為基礎，立足于貓細小病毒、貓杯狀病毒及貓皰疹病毒的生物學特征，對聚合酶鏈反應檢測貓幾種病毒的應用現狀進行綜述，為實驗用貓的檢測以及實驗用貓的標準化奠定了基礎，同時在公共衛生學方面也具有重要意義。

1 聚合酶鏈反應在貓細小病毒病診斷中的應用

1．1 貓細小病毒生物學特征貓細小病毒(Feline parvovirus virus，FPV)具有高度接觸傳染性，以引起貓科動物以高熱、嘔吐、白細胞嚴重減少和腸炎為主要臨床特征的病毒性傳染病，故又稱之為貓傳染性腸炎病毒、貓泛白細胞減少癥病毒和貓瘟病毒;病毒核酸為二十面體對稱的單股、無囊膜的DNA病毒，直徑為20～24 nm;FPV除了感染貓科動物外，還感染浣熊、水貂和狐貍等動物，該病對各種野生動物造成極大的威脅，具有很高的發病率和死亡率。目前，FPV在細小病毒屬中屬于感染范圍最廣、致病性最強的一種病毒［1］。

1．2 貓細小病毒病病毒的診斷貓細小病毒廣泛存在于世界各地，是發病率和死亡率高的一種病毒性傳染病，PCR作為靈敏度高、準確的一種檢測方法在FPV診斷中具有重要的價值。李爽建立了具有高度特異性和靈敏性的FPV PCR檢測方法，對長春地區某寵物醫院的疑似FPV感染貓進行檢測，結果為FPV陽性［2］。王翀根據GenBank中FPV NS基因、FCV ORF2基因、FHV-I TK基因設計3對引物，貓細小病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒可在同一PCR體系中擴增出來，最低檢出限分別為101．5TCID50、101．9TCID50、101．2TCID50，血清檢測結果表明，陽性率分別為5%、2．5%、4．1%，該方法具有良好的特異性和敏感性［3］。王吉建立FPV的PCR檢測方法，研究結果表明，與貓皰疹病毒I型、貓冠狀病毒、貓合胞體病毒、貓免疫缺陷病毒均無交叉反應，檢測病毒最小滴度為5 lg TCID50/mL，DNA模板濃度為4．9×102拷貝/μL，在貓臨床樣本33份中檢測出21份FPV陽性［4］。邱杰建立了FPV PCR快速檢測方法，檢出的最小DNA濃度為6．19×10－8μg/μL ，檢出DNA濃度低于1fg/μL，靈敏度高、特異性高，在3004份樣品中檢出13份FPV核酸陽性，可應用于FPV流行病學調查［5］。貓細小病毒還可以感染貓科動物，喬軍應用PCR技術對1只病死東北虎的脾臟進行檢測，得到與標準FPV完全一致的核酸條帶，而對輪狀病毒、犬腺病毒、犬瘟熱的檢測均為陰性，PCR技術的特異性與靈敏性遠遠高于常規的血凝和血凝抑制試驗［6］，為虎、熊貓和獅子等動物的早期診斷以及進出口部門檢疫工作提供了技術支持。

2 聚合酶鏈反應在貓杯狀病毒診斷中的應用

2．1 貓杯狀病毒生物學特征貓杯狀病毒(Feline calicivirus，FCV)是杯狀病毒科、水皰性病毒屬的成員之一［7］;能夠引起貓科動物急性口腔潰瘍、結膜炎、急性關節炎、上呼吸道傳染病和慢性胃腸炎等疾病，故又叫貓傳染性鼻-結膜炎;病毒是無囊膜的單股正鏈RNA，直徑為30～40 nm;FCV在貓科動物中廣泛流行，是危害貓科動物的重要病原之一，在我國貓群、虎和獵豹之間也存在感染FCV流行的報道［8］。FCV可導致動物患血熱樣疾病，FCV的變異也可導致VSD的暴發，引起人們高度重視。

2．2 貓杯狀病毒的診斷貓杯狀病毒呈世界性分布，接種疫苗的動物仍然可以成為持續性感染源，造成疾病的流行。該病的鑒定方法有病毒分離鑒定和血清學試驗等多種方法，然而PCR方法具有敏感性高、特異性強、操作簡易等優點，對有效控制FCV的傳播提供了有效的方法。鄭翠玲應用RT-PCR和重組PCR技術擴增了FCV CH-GD株的全基因，用DNAStar軟件比較分析其氨基酸序列和核苷酸序列，采用重組PCR方法獲得了含突變位點的FCV全長cDNA克?。?］。劉曄設計一對FCV衣殼蛋白基因正反向引物，該病毒為自然弱毒株，并進行了免疫幼貓的試驗，產生較高水平的中和抗體，能抵抗FCV強毒株攻擊而不發?。?0］。Mohamed等建立了檢測FCV的實時熒光定量PCR法，并用此法和病毒分離法對122個樣本進行了檢測，該法和病毒分離法都具有較高的靈敏度與特異性，但是該檢測方法用時更短［11］。姜雪建立了檢測FCV的熒光定量PCR方法，只能檢出FCV而其他貓相關病毒為陰性，線性范圍為2．264×1011－2．264×101拷貝/μL，重復性試驗變異系數為2．158%，對24份疑似FCV貓唾液檢測，結果與病毒分離鑒定一致［12］。Chris等建立了SYBR greenI實時熒光定量PCR方法，并且對FCV分離株進行了檢測，反應結束后，根據熔解曲線和熔解溫度可區分出不同FCV分離株，其特異性強、敏感度高，可精確定量病毒模板的濃度［13］，具有潛在的應用價值。

3 聚合酶鏈反應在貓皰疹病毒診斷中的應用

3．1 貓皰疹病毒生物學特征貓皰疹病毒(Feline herpesvirus，FHV)屬于皰疹病毒科、甲型皰疹病毒亞科的成員，病毒核酸為有囊膜、雙鏈DNA，直徑為128～168 nm;可引起的貓的急性和高度接觸性的上呼吸道感染［14］;病原的組織嗜性廣，不僅侵害呼吸系統，還侵害神經系統、生殖系統、胚胎等。病毒在患病貓的舌、鼻、結膜、咽喉、氣管、支氣管等部位增殖，發病率可達到100%，死亡率可達到50%;目前國內沒有專門的貓皰疹病毒等貓易感病毒臨床檢測的機構，對于實驗用貓未見有開展FHV-Ⅰ檢測的報道;FHV-Ⅰ感染所致疾病與貓杯狀病毒、貓細小病毒引起呼吸道感染和貓肺炎在臨床上很難區分［15-16］，需利用實驗室方法進行鑒別診斷。

3．2 貓皰疹病毒的診斷貓皰疹病毒I型的檢測主要是采用病毒的分離鑒定、組織學檢查、免疫熒光等方法［17］，國外已有人建立了針對FHV-1的PCR檢測技術［18-19］，國內數人也都建立了PCR檢測方法。劉寶山建立FHV-Ⅰ型PCR方法，擴增序列與GenBank上序列同源性達到100%，特異性高、靈敏度高，可以從103個拷貝的樣品中檢測出FHV-Ⅰ型，臨床樣品檢測結果表明，與間接免疫熒光的陽性符合率可達95．8%［20］。林穎設計FHV-Ⅰ型gD基因的引物，建立了PCR診斷方法，可從含有103個拷貝的樣品中檢測出FHV-Ⅰ，靈敏性高;特異性強，僅能擴增出貓三聯弱毒苗［21］。屈哲設計針對TK基因的引物，PCR產物與GenBank基因部分序列同源性達到100%，建立的PCR檢測方法的敏感性試驗能檢測出的最低DNA量約為300 pg［22］。王吉建立的PCR方法靈敏性高，可檢測FHV-Ⅰ最小滴度為7 lg TCID50/mL，相應的DNA模板濃度為1．46×102拷貝/mL，在15份貓臨床樣本中檢出10份FHV-Ⅰ陽性，適合于臨床對該病的感染檢測［23］。李林翔建立虎源FHV-Ⅰ巢式PCR的快速鑒定方法，可以特異擴增出FHV-Ⅰ的gD基因片段，檢測極限是1×102copies/μL，敏感性明顯高于一步法PCR，對疑似FHV-1的樣品進行檢測，結果與病毒分離鑒定一致［24］。實時熒光定量PCR技術不僅可以提高檢測的特異性與準確性，還可以對病毒核酸進行定量分析。王吉建立的實時熒光定量PCR檢測方法實現了對貓FHV-Ⅰ核酸的定量檢測分析，線性范圍1×102－1 ×109copies/μL。檢測靈敏度可達到10copies/μL。批內變異系數均小于5%，且適合于臨床FHV-Ⅰ的快速定量檢測［25］。劉健建立的FHV-Ⅰ實時熒光定量PCR方法可特異地檢測出FHV-Ⅰ的DNA，敏感性達到75 fu/μL，反應效率達到107%，R2值為0．9 965，Ct值的變異系數低于2%，應用該方法對上海地區寵物門診送檢的疑似FHV-Ⅰ感染的樣品進行檢測，其陽性率達到27．78%，高于普通PCR的15．87%［26］。

4 結語

隨著分子生物學的不斷發展，人們對貓細小病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒這3種病毒的認識越來越深刻，在基因組和分子生物學功能等方面取得較大進展，貓細小病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒作為貓的重要傳染病原，嚴重威脅貓科動物的養殖，至今尚無特效藥物和有效的治療辦法控制其發生和復發，在診斷和預防方面還需要進一步建立準確、簡便、快速的方法;傳統疫苗在病毒防制過程中起到重要的作用，大多數尚處于實驗研究階段，免疫原性差，迫切地需要制備高效、穩定、無毒副作用的新型疫苗，因此研制開發新型、安全、高效的疫苗具有很好的應用前景。

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S852．65+9．2

A

0529-6005(2017)01-0072-03

2016-08-15

吉林省教育廳科學技術研究項目(2015209)

杜翔宇(1989-)，碩士生，從事分子病原微生物與分子免疫學研究，E-mail:dxy1209@163．com

董浩，E-mail:donghao_jlau@163．com