施氮量對烤煙煙葉抗氧化系統及質量的影響

李利建， 王 濤， 毛 嵐， 李 凌， 趙應虎， 趙友誼， 任 情， 劉建軍， 張宏景

(云南省煙草公司 曲靖市公司，云南曲靖 655000)

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施氮量對烤煙煙葉抗氧化系統及質量的影響

李利建， 王 濤， 毛 嵐， 李 凌， 趙應虎， 趙友誼， 任 情， 劉建軍， 張宏景

(云南省煙草公司 曲靖市公司，云南曲靖 655000)

[目的]研究施氮量對烤煙煙葉抗氧化系統及質量的影響。[方法]以K326為試驗材料，對不同施氮水平烤煙生長成熟期間煙葉活性氧含量、SOD活性、GR活性、APX活性、抗氧化劑含量、化學成分進行了研究。[結果]隨著煙葉在田間的生長成熟，煙葉內超氧陰離子產生速率、過氧化氫的含量呈增加趨勢；抗氧化酶活性整體呈先上升后下降的趨勢；抗氧化劑GSH逐漸下降；AsA含量在生長前期逐漸增加，但生長后期逐漸下降。不同施氮水平對烤煙煙葉生長成熟期間抗氧化系統有顯著影響。在高氮水平下，煙葉內活性氧清除系統中的自由基清除劑(GSH、AsA)和相關酶活性(SOD、GR、APX)均顯著或極顯著高于低氮水平處理。隨著施氮量的增加，烤后煙葉含氮化合物顯著增高，蛋白質、淀粉、葉綠素和類胡蘿卜素等大分子物質降解量減少，石油醚提取物顯著減少，但對鉀和氯影響不顯著，煙葉質量降低。[結論]烤煙大田管理中適量施氮(45.0 kg/hm2)有利于煙葉生長前期保持較高抗氧化活性，抵御脅迫，在成熟期確保適時成熟，提高煙葉質量。

烤煙；氮；抗氧化系統；化學成分

葉片的光合作用是植物全株光合產物主要源，光合作用時間的長短主要取決于葉片衰老的進程[1]。因此，烤煙煙葉的產量和質量與其衰老密切相關。目前研究普遍認為作物的衰老過程是細胞和組織中不斷進行著自由基損傷反應的總和。煙株打頂后，進入成熟期，煙葉內超氧自由基和過氧化氫迅速增加，抗氧化系統及其相關酶活性持續下降，氧化脅迫造成衰老加劇[2-5]。但通過外源添加抗氧化劑能明顯延緩煙葉的衰老[6]。氮素是煙草生長發育的必需營養元素，在保護酶代謝中起著重要作用。氮素缺乏會引起作物葉片葉綠素、蛋白質含量下降，丙二醛含量升高，加速葉片衰老進程[7]。在煙草氮肥施用中，氮肥不足導致煙葉提前衰老，煙葉質量差；氮肥過多則成熟期推遲，病害加重，內在化學成分協調性較差。氮肥水平和形態對煙葉生長及質量具有顯著影響[8]。但目前有關施氮量對煙葉生長成熟過程抗氧化系統及其質量影響的研究鮮有報道?；诖?，該試驗研究了不同供氮水平對煙葉活性氧、抗氧化系統和煙葉質量的影響，以期為特色優質煙葉生產中合理施肥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗于2014年在云南省師宗縣大同街道長橋村進行。供試烤煙品種K326，4月15日膜下小苗移栽，行距120 cm，株距50 cm，按照優質烤煙生產技術規范栽培管理。

1.2 試驗設計 試驗設3個施氮水平處理，低氮(T1)施用純氮22.5 kg/hm2，中氮(T2)施用純氮45.0 kg/hm2，高氮(T3)施用純氮67.5 kg/hm2；小區面積100 m2，3次重復，隨機排列，試驗區周圍設置保護行。不同處理間磷、鉀肥施用量相同，都為P2O590.0 kg/hm2、K2O 157.5 kg/hm2，施用方法和時間一致。試驗所用氮、磷、鉀肥分別為尿素(N 46%)、過磷酸鈣(P2O516%)和硫酸鉀(K2O 51%)；磷肥全部基施，氮肥和鉀肥的追肥在移栽后25～30 d澆施，基肥與追肥比例為17∶3。以幼葉長出0.5 cm時開始計算葉齡，自葉齡25 d起每隔15 d取各處理生長基本一致的第10位葉對抗氧化系統各項指標進行測定；各處理分別取中橘三(C3F)等級的烤后煙葉1 kg進行主要化學成分的測定。

1.3 測定項目與方法 過氧化氫和抗壞血酸含量參照李合生等[9]的方法測定，谷胱甘肽含量參照Arnon[10]的方法測定；谷胱甘肽還原酶活性測定參照Foyer等[11]的方法，抗壞血酸過氧化物酶活性測定參照Nakano等[12]的方法?？竞鬅熑~總氮、蛋白質、煙堿、淀粉、總糖、還原糖、鉀、氯和石油醚提取物含量測定參照王瑞新等[13]的方法，葉綠素和類胡蘿卜素含量測定采用分光光度法[14]。

1.4 數據處理 采用Microsoft Excel 2003和SPSS 17.0進行繪圖和數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 施氮量對煙葉活性氧含量的影響 植物體內活性氧是有氧轉化而成的氧代謝產物及其衍生的含氧物質，主要包括超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等[15]。由圖1a可知，烤煙田間生長成熟過程中煙葉內超氧陰離子的產生速率呈上升趨勢。在55 d以前，各處理之間差異不顯著；55 d以后，各處理間差異增大，且超氧陰離子產生速率顯著增加，其中T1處理的超氧陰離子產生速率最高，而T3處理最低。由圖1b可知，過氧化氫含量也呈逐漸上升趨勢，在葉齡55 d時隨著煙葉的逐漸成熟過氧化氫含量增幅加快，并在葉齡85 d時達到最高；不同施氮水平下，各階段T3處理的過氧化氫含量較高，其次為T2處理，T1處理最低；且T3處理煙葉過氧化氫含量與T1處理之間差異極顯著。

注:同時間不同大、小寫字母分別表示處理間差異達到0.01和0.05顯著水平。Note:Different capital letters and lowercases at the same leaf age indicated significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively. 圖1 施氮量對煙葉活性氧含量的影響Fig. 1 Effects of nitrogen application level on active oxygen content of tobacco leaves

2.2 施氮量對煙葉抗氧化酶活性的影響

2.2.1 施氮量對煙葉SOD活性的影響。由圖2可知，不同施氮量對煙葉生長成熟過程中SOD活性的影響顯著，在葉齡55 d內，各處理SOD活性均呈緩慢增加的趨勢；55 d后T1處理的SOD活性逐步下降，T2處理繼續增加并在70 d后開始下降，而T3處理則一直呈增加趨勢。

圖2 施氮量對煙葉SOD活性的影響Fig. 2 Effects of nitrogen application level on SOD activity of tobacco leaves

2.2.2 施氮量對煙葉谷胱甘肽-抗壞血酸循環系統酶活性的影響。植物在逆境脅迫下，通過提高GR和APX的活性能增強活性氧的清除作用，降低氧化脅迫[16-17]。由圖3a可知，烤煙生長成熟過程中，煙葉GR活性先升高并保持較高酶活性，然后在葉齡70 d后呈下降趨勢。不同施氮水平的3個處理中，在25 d時T2處理GR活性最高，而T1處理最低；隨著煙葉生長成熟，T3處理的酶活性一直保持較高水平，其次為T2處理，T1處理酶活性較低；在85 d時，T2和T3處理的GR活性差異不顯著，但均與T1處理之間差異極顯著。由圖3b可知，APX活性在生長成熟過程中25～55 d時呈上升趨勢，55 d后逐漸下降；3個施氮水平處理中，整個生長成熟期均以T3處理的酶活性較高，T1處理較低；其中，在25～40 d時T2和T3處理煙葉酶活性差異不顯著，但均與T1之間差異極顯著；55～70 d時T3處理煙葉酶活性下降幅度明顯小于T1和T2處理，但70 d后酶活性下降幅度明顯增大。

2.3 施氮量對煙葉抗氧化劑含量的影響 GSH是植物抗氧化系統中重要的非酶類物質，其含量和GSH/GSSG比值是激活植物抗性基因的信號之一[18]?？緹熒L成熟過程中GSH含量呈逐漸下降趨勢，并在55 d后下降趨勢有所加快(圖4a)。其中，在25 d時3個不同施氮水平處理的煙葉內GSH含量差異顯著；隨著煙葉的成熟衰老，煙葉內GSH含量差異顯著減小；在40～55 d時T1和T2處理差異不顯著，但均與T3處理差異顯著；70 d時，3個處理的差異均不顯著；而在85 d時，T2處理與T3和T1處理差異均不顯著，但T1處理與T3處理間差異顯著。

AsA是植物體內普遍存在的一種高豐度小分子的非酶類自由基清除劑，能夠直接清除O2-·和H2O2等，對植物抵抗脅迫有重要作用[19]。由圖4b可知，烤煙在生長成熟過程中AsA含量呈先上升后緩慢下降的趨勢，在葉齡40 d 時最大，而在70 d時下降幅度略有增加。3個不同施氮水平處理中，T3處理的煙葉內AsA含量一直高于其他2個處理，在40 d時3個處理差異極顯著；在25和55～85 d時T2和T3處理間差異顯著，而T2處理和T3與T1處理差異均達到極顯著水平。

圖3 施氮量對煙葉GR和APX活性的影響Fig. 3 Effects of nitrogen application level on the GR and APX activities of tobacco leaves

注:同時間不同大寫和小寫字母分別表示處理間差異達到0.01和0.05顯著水平。Note:Different capital letters and lowercases at the same leaf age indicated significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively. 圖4 施氮量對煙葉GSH和AsA含量的影響Fig. 4 Effects of nitrogen application level on the GSH and AsA contents of tobacco leaves

2.4 施氮量對烤后煙葉主要化學成分的影響 由表1可知，不同施氮水平對烤后煙葉內在品質有重要影響?？竞鬅熑~含氮化合物隨著施氮量的增加而增加，即T3處理的含氮化合物最高；3個處理煙葉總氮含量為1.88%～3.25%，均處于適宜范圍，但T2處理較接近最適值，且T3處理總氮含量與T1和T2處理間均達到差異極顯著，T1和T2處理間差異顯著；蛋白質含量中，T3處理含量明顯高于優質煙葉要求范圍7%～10%，T1和T2處理差異不顯著且含量適宜；3個處理的煙堿含量均比較適宜，其中T2和T3處理間差異不顯著，但這2個處理均與T1處理間差異顯著。淀粉含量以T1處理最低，T3處理最高，其中T1與T2和T3處理間差異極顯著，T2和T3處理間差異顯著。T2處理的總糖含量和還原糖含量較高，但3個處理之間差異顯著；適宜施氮量有利于煙葉淀粉降解和糖類物質的積累。色素類物質中，3個處理之間略有差異，其中T3處理的葉綠素a含量最高，與其他2個處理間差異顯著；葉綠素b含量在3個處理之間差異不顯著；T3處理類胡蘿卜素含量最高，與T1處理間差異顯著，但與T2差異不顯著。不同施氮量對烤后煙葉鉀和氯含量無顯著影響，3個處理的鉀和氯差異不顯著。T2處理的石油醚提取物最高，與T1處理間差異顯著，與T3處理間差異極顯著。綜上可知，中氮水平(45.0 kg/hm2)的施氮量有利于烤后煙葉品質的提高。

3 結論與討論

隨著植物的生長成熟，在衰老過程中，植物體內活性氧的產生與清除的動態平衡遭到破壞，生物氧自由基會大量積累[20-21]?？緹熢谔镩g生長成熟過程中，進入成熟期隨著成熟度的增加煙葉由氮代謝轉向碳代謝，葉片結構逐漸疏松，細胞結構被破壞，細胞膜透性增加[22-23]。試驗結果表明，隨著煙葉在田間的生長成熟，煙葉內超氧陰離子的產生速率、過氧化氫的含量一直呈增加的趨勢；抗氧化酶活性整體呈現先上升后下降的趨勢；抗氧化劑GSH逐漸下降；AsA的含量在生長前期逐漸增加，但在生長后期逐漸下降，這與張波等[24]研究結果基本一致。李明軍等[25]研究認為植物葉片在衰老開始時，能夠通過GSH和AsA含量的上升來增加抵御能力，但隨著衰老的加劇，AOS大量積累降低了相關酶活性，GSH和AsA含量開始下降。這與文錦芬等[26]的研究結果略有差異，可能是由于試驗處理和生態環境不同所導致的。

植物葉片中的抗氧化系統存在明顯的品種差異，且活性高低也受到生態環境的影響。該試驗條件下，不同施氮水平對烤煙煙葉生長成熟期抗氧化系統具有顯著的影響，低氮水平下煙葉內活性氧的含量雖然較低，但活性氧清除系統中的自由基清除劑和相關酶活性也普遍偏低；而在高氮水平下，煙葉內活性氧清除系統中的自由基清除劑和相關酶活性均顯著或極顯著高于低氮水平處理，煙葉抗氧化性提高，延緩葉片衰老。這主要是由于增施氮肥有利于提高葉片光能的吸收和轉化效率，改善活性氧清除酶的代謝合成[27]。馬松等[28]研究也表明，通過施用控釋復合肥延緩肥料釋放能顯著降低超氧離子的產生，提高活性氧清除系統活性，延遲衰老。但烤煙以收獲煙葉為主，要求產量與質量并重。隨著施氮量的增加，煙葉活性氧清除系統活性較高，衰老延遲，但易造成氮代謝推遲，對光合效率產生反饋抑制，煙葉貪青晚熟，從而造成煙葉烘烤特性較差；較低的施氮量，煙葉提前衰老成熟，干物質積累較少，對煙葉質量不利[29-30]。而該試驗結果也表明，隨著施氮量的增加，烤后煙葉含氮化合物顯著增高，蛋白質、淀粉、葉綠素和類胡蘿卜素等大分子物質降解量減少，石油醚提取物顯著減少，但對鉀和氯影響不顯著，煙葉質量降低。李春儉等[31]、王新發等[32]也認為施氮量過高造成色素等大分子物質殘留量較高，煙葉品質下降。因此，在烤煙大田管理中，適量施氮有利于煙葉生長前期保持較高抗氧化活性，抵御環境脅迫；在成熟期確保適時成熟，提高煙葉質量。

表1 施氮量對烤后煙葉化學成分的影響

注:同列不同大寫和小寫字母分別表示差異達到0.01和0.05顯著水平。

Note:Different capital letters and lowercases in the same column indicated significant differences at 0.01 and 0.05 levels,respectively.

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Effects of Nitrogen Application Level on the Antioxidant Defense System and Quality of Flue-cured Tobacco Leaves

LI Li-jian,WANG Tao,MAO Lan et al

(Qujing Branch of Yunnan Tobacco Company,Qujing,Yunnan 655000)

[Objective] To research the effects of nitrogen application level on the antioxidant defense system and quality of flue-cured tobacco leaves. [Method] Taking K326 as experimental materials,we researched the effects of different nitrogen application levels on active oxygen content,SOD activity,GR activity,APX activity,antioxidants content and chemical components in tobacco leaves. [Result] With the growth and ripening of tobacco leaves in fields,generation rate of O2-· and content of hydrogen peroxide of tobacco leaves presented increasing trend. Activities of SOD,GR and APX increased firstly,and then decreased. Content of AsA increased at early growth stage and decreased gradually at late growth stage. Nitrogen application level had significant effects on antioxidant defense system. The contents of free radical scavenger (GSH,AsA) and activity of related enzymes (SOD,GR,APX) of antioxidant defense system at high nitrogen level were significantly or extremely significantly higher than those at low nitrogen level. With the increasing of nitrogen application level,the contents of nitrogen compounds of cured tobacco leaves increased significantly,while degradation amount of macro molecular substance decreased,such as protein,starch,chlorophyll and carotenoid,and the content of petroleum ether extract also reduced. However,it showed no significant impacts on potassium and chlorine. Thus,the quality of tobacco leaves reduced. [Conclusion] In field management of flue-cured tobacco,rational application of nitrogen fertilizer (45.0 kg/hm2) is beneficial to keep the higher activity of antioxidant defense system to resist stress at early growth stage,mature timely at mature period,and improve the quality of tobacco leaves.

Flue-cured tobacco; Nitrogen; Antioxidant defense system; Chemical components

中國煙草公司云南省公司項目(2014YN23)。

李利建(1972- )，男，云南曲靖人，助理農藝師，碩士，從事煙草生產與收購管理研究。

2016-11-09

S 572

A

0517-6611(2016)36-0035-04