經典瞬時受體電位通道1在胃癌組織中的表達及其生物學意義

胡寧，朱曉鋒

作者單位：咸寧市中心醫院湖北科技學院附屬第一醫院，a胃腸外科一病區，b心胸外科，湖北咸寧437100

胃癌是我國最常見的消化道腫瘤，占2015年我國癌癥發病順位的第2位（40.3萬例），且占我國因癌死亡的第3位（29.1萬例）。盡管手術切除、放化療和靶向藥物等措施在胃癌的診治中取得了較大進展，但終末期胃癌的5年生存率仍不足30%。

經典瞬時受體電位通道（transient receptor potential canonical，TRPC）為一類分布廣泛的鈣離子通道，通過調控鈣離子內流，參與一系列的生物學過程。研究表明，經典瞬時受體電位通道1（TRPC1）通道在多種惡性腫瘤中表達上調，包括乳腺癌、甲狀腺癌和肝細胞癌等。然而，尚不清楚TRPC1通道在胃癌中的表達及其生物學效應。因此，本研究首先檢測TRPC1在胃癌組織中的表達情況，分析其與胃癌病人臨床病理特征的關系，以期為胃癌的精準治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 臨床標本收集

收集咸寧市中心醫院2015年1月至2018年4月93例手術切除的胃癌和癌旁組織標本，所有病人術前均未接收放、化療或其他抗腫瘤治療。其中男性62例，女性31例，年齡范圍為35～79歲。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，所有病人均簽署了知情同意書。

1.2 試劑

TRPC1抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。人胃癌MGC-803細胞購自中科院上海細胞庫。TRPC1小分子干擾RNA（siRNA-TRPC1）質粒購自 上 海Genechem公 司。Trizol、PrimeScriptRTPCR試劑盒、噻唑藍試劑盒和凋亡流式試劑盒均購自瑞士Roche公司。RPMI1640培養基購自美國Gibco公司。丙二醛、活性氧和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗方法

1.3.1

免疫組織化學染色包埋后將組織標本切成4～5 μm厚的薄片，經脫蠟、抗原修復等處理后，滴加3%的小牛血清封閉。分別加入適量的TRPC1抗體和二抗，復染細胞核后脫水封片，顯微鏡下觀察。結果判定：（1）以陽性細胞數＜5%計為0分，5%～25%計為1分，＞25%～50%計為2分，＞50%～75%計為3分，＞75%～100%計為4分。（2）以無著色計為0分，黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。將兩者得分相乘后：以＜3分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.3.2

細胞培養和轉染將復蘇后的人胃癌MGC-803細胞培養在RPMI1640培養基，選擇處于對數期的細胞，接種于6孔板中。按照說明書的步驟操作，利用siRNA沉默TRPC1的表達。根據實驗設計，將其分為三組：對照組、空載體組和轉染組。其中對照組不做任何處理，空載體組僅轉染無任何靶基因的siRNA，轉染組則轉染siRNA-TRPC1。

1.3.3

MTT法檢測細胞增殖情況將轉染后的人胃癌MGC-803細胞接種于96孔板中，密度為5×10/孔，設置3個復孔。分別于轉染后0、12、24、48、72 h，加入7 g/L的噻唑藍溶液，孵育5 h后加入二甲基亞砜溶液。37℃孵育10 min后，酶標儀檢測各組細胞在490 nm波長處的吸光度值，以對照組為參照，計算細胞存增殖活性。上述實驗均重復3次。

1.3.4

逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測細胞mRNA水平收集細胞，加入Trizol試劑提取總RNA，并將其反轉錄成互補DNA（cDNA）。按照PrimeScriptRT-PCR試劑盒說明書的操作步驟，在RT-PCR儀進行PCR擴增。以GAPDH作為內參，進行定量分析。GAPDH正向引物序列為5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'，反向引物序列為5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。TRPC1正 向 引 物 序 列為5'-ACTTCAACAGCGA-3'，反向引物序列為5'-ATACCAGGAAATGAGC-3'。上述實驗均重復3次。

1.3.5

蛋白質印跡法（Western blotting）檢測細胞蛋白水平收集細胞并提取細胞蛋白，檢測TRPC1的蛋白表達。具體操作步驟如下：每孔加入200 μL裂解液，提取細胞總蛋白并進行定量分析。制備凝膠并按每孔40 μg蛋白量上樣電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上。脫脂奶粉封閉1 h后，加入適量的一抗，4℃孵育，等滲緩沖鹽溶液（TBST）洗膜后加入二抗，37℃孵育1h。使用Odyssey成像系統掃膜，以GAPDH為參照物，檢測TRPC1的表達水平。上述實驗均重復3次。

1.3.6

檢測細胞氧化應激水平收集細胞，檢測各組樣品的蛋白濃度，按照各試劑盒說明書的步驟操作，檢測SOD、丙二醛和活性氧的水平。上述實驗均重復3次。

1.3.7

檢測細胞凋亡水平收集細胞，加入200 μL的結合緩沖液使細胞重懸。分別加入5 μL膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙啶（PI）染色液，上機檢測細胞凋亡水平。上述實驗均重復3次。

2 結果

2.1 TRPC1在胃癌及癌旁組織中的表達

免疫組化結果顯示TRPC1蛋白表達于細胞內，呈棕黃色顆粒。TRPC1在胃癌組織的陽性表達率顯著高于癌旁組織（79.6%比20.4%，

χ

=65.054，

P

＜0.001）。

2.2 TRPC1的表達與胃癌病人臨床病理特征的關系

TRPC1的高表達與腫瘤的TNM分期、分化程度和淋巴結轉移相關（均

P

＜0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小、遠處轉移、吸煙史和飲酒史無關（均

P

＞0.05），見表1。

表1 經典瞬時受體電位通道1（TRPC1）的表達與胃癌臨床病理特征的關系/例（%）

2.3 siRNA靶向沉默TRPC1的效果

RT-PCR和蛋白質印跡法結果顯示，轉染組胃癌MGC-803細胞中TRPC1 mRNA和蛋白表達明顯低于對照組（

P

＜

0.05

）。而對照組與空載體組比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表2和圖1。

圖1 蛋白質印跡法檢測轉染后各組人胃癌MGC-803細胞TRPC1蛋白水平

表2 轉染后的人胃癌MGC-803細胞經典瞬時受體電位通道1（TRPC1）mRNA和蛋白相對表達量/±s

2.4 細胞氧化應激水平檢測

與對照組相比，siRNA-TRPC1轉染組丙二醛和活性氧水平明顯升高，抗氧化酶SOD活性降低（

P

＜0.05）。而與對照組比較，空載體組細胞丙二醛、活性氧和SOD水平的差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表3。

表3 siRNA沉默TRPC1對人胃癌MGC-803細胞氧化應激水平的影響/±s

2.5 細胞增殖活性

MTT法檢測結果顯示，72 h時，siRNA-TRPC1轉染組細胞增殖活性明顯低于對照組（

P

＜0.05），而對照組和空載體組間的差異無統計學意義（

P

＞0.05）。見表4。

表4 各組人胃癌MGC-803細胞轉染后各時點的增殖活性比較/±s

2.6 細胞凋亡水平檢測

三組凋亡率比較，

F

=356.705，

P

＜0.001。與對照組凋亡率（2.23±0.35）%相比，siRNA-TRPC1轉染組（10.13±0.87）%顯著升高（

P

＜0.05），而空載體組（2.37±0.39）%則差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

3 討論

目前，胃癌已經成為嚴重威脅我國居民健康的重大疾病之一。因此，深入探究胃癌的發病機制，尋找新的治療靶點，對于胃癌的防治具有重要意義。本研究結果顯示胃癌組織中TRPC1的表達較癌旁組織明顯升高，且TRPC1的高表達與TNM分期、分化程度和淋巴結轉移呈顯著正相關，提示TRPC1可能在胃癌的致病過程中具有重要的作用。

1995年，Wes等首次通過原位雜交技術克隆出人TRPC1蛋白，并定位于3號染色長臂的22-24區。人和小鼠的TRPC1通道蛋白均包含753個氨基酸序列，分子量為91 kDa。研究表明，TRPC1不僅表達在正常器官和組織，在多種腫瘤組織中也均有表達。李英等證實，TRPC1在乳腺癌組織中呈高表達，且和乳腺癌的病理類型、分級有關。研究證實，敲除人濾泡性甲狀腺癌細胞中的TRPC1的表達，可顯著降低癌細胞的增殖和遷移、促進腫瘤細胞的凋亡。同時有研究也表明，TRPC1在肝細胞癌中的表達顯著上調，且siRNA沉默人肝癌Huh7細胞中的TRPC1表達，可明顯抑制Huh7細胞的增殖活性。本研究提示轉染組細胞TRPC1的mRNA和蛋白質表達水平明顯低于對照組，沉默TRPC1的表達可顯著降低MGC-803細胞的增殖活性。

氧化應激損傷是指各種病理生理刺激導致活性氧在體內大量蓄積，繼而出現細胞或組織損傷。研究表明，活性氧在腫瘤進展過程中發揮著“雙刃劍”作用，即低濃度的活性氧通過誘導DNA突變、激活原癌基因和上調腫瘤細胞的代謝水平等促進腫瘤細胞異常增殖。而高濃度的活性氧則抑制腫瘤細胞的增殖，誘導細胞凋亡。徐湖波等研究表明，上調胃癌細胞的活性氧水平可以抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡。Badr等證實對乙酰氨基酚通過抑制TRPC1的激活，上調活性氧水平，促進人肝癌HepG2的凋亡。與之類似，本研究表明，siRNA沉默TRPC1的表達可顯著升高胃癌MGC-803細胞活性氧水平，抑制胃癌細胞的增殖，促進凋亡。

綜上所述，TRPC1在胃癌組織中高表達，且與胃癌的TNM分期、分化程度和淋巴結轉移密切相關。siRNA沉默TRPC1的表達可以上調MGC-803細胞的氧化應激水平，抑制腫瘤細胞的增殖。然而，本研究仍有不足之處：一是隨訪時間較短，沒有探討TRPC1的表達與胃癌病人的預后和生存率的關系；二是沒有進行動物實驗，也沒有在多種胃癌細胞中進行驗證。因此，這些不足之處是我們接下來的研究方向。