規范檢測技術控制發病率—《裂頭絳蟲幼蟲檢測》標準解讀

隨著人民生活水平的不斷提高，食物來源、飲食方式和飲食習慣的多樣化，因食源性寄生蟲造成的食品安全問題亦越來越突出，由此引發的食源性寄生蟲病發病人數及發病率大幅度增加。近年來，隨著生食和半生食方式的引入和推廣,使得食源性寄生蟲的感染率猛增，海洋、淡水魚類（包括深海魚、淺海魚、淡水回游魚、蛙）等水產品的攝入量也較以往大大增加，特別是三文魚、鱒魚、金槍魚、馬哈魚、蛙類等一些水產品的市場占有率大大提升，使裂頭絳蟲病、異尖線蟲病等寄生蟲病的發病率逐年升高，據文獻回顧，我國20世紀50年代以來報道因生食海魚而感染闊節裂頭絳蟲病12例，主要來自黑龍江省，其中，臺灣省報道2例。近兩年，大量的三文魚、金槍魚、鱒魚等深海魚投放市場，在上海出現了多例闊節裂頭絳蟲感染患者；自2000年以來，因生吃或半生吃蛙、蛇肉和蛇膽等感染的曼氏裂頭蚴的病例達104例，由此看出，魚類、蛙類等水產品中的裂頭蚴感染的情況日益嚴重，但我國至今也沒有關于水產品中裂頭絳蟲幼蟲的檢測標準，這給食品安全問題敲響了警鐘。因此，規范水產品中寄生蟲幼蟲的檢測標準十分必要，此標準的實施可為相關水產品生產企業提供安全質量控制標準，為疾病控制和檢測機構提供檢測規范。

1 標準編制過程與方法

受國家衛生和計劃生育委員會政策法規司委托，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所、上海出入境檢驗檢疫局和上海市疾病預防控制中心有關專家組成標準編制工作組。編寫組通過查閱科技文獻及有關文庫，收集國內外有關裂頭絳蟲幼蟲（裂頭蚴）檢測方法方面的最新研究資料，并進行分析和整理；首先對目前國內外檢查裂頭蚴最常用的壓片法和消化法進行評估和規范；接著，根據基因庫中報告的裂頭屬絳蟲幼蟲的基因序列保守片段，參考國內外相關研究資料[1-6]，選擇可用于裂頭屬絳蟲幼蟲擴增的特異性引物，同時用國內采集的裂頭屬絳蟲幼蟲、裂頭屬絳蟲成蟲，并同時以迭宮屬絳蟲幼蟲作為對比研究，對PCR方法進行了驗證，確定引物和體系的適用性。在此基礎上按照我國有關標準制修訂的要求和規范，起草了《裂頭絳蟲幼蟲檢測技術》征求意見稿。2015年11月11日，第七屆國家衛生標準委員會寄生蟲病標準專業委員會24位專家對此標準進行了評審，修改完成了《裂頭絳蟲幼蟲檢測技術》送審稿。

在此基礎上，采用專家咨詢法廣泛征求全國各有關醫療機構、疾控機構、醫學院校、科研院所、檢驗檢疫機構等單位有關知名專家學者意見，對反饋意見進行討論、斟酌。并修改相應內容，完成上報稿通過國家衛生標準委員會寄生蟲病標準專業委員會會審，認為該標準符合科學性、實用性、完整性和準確性等制標要求，上報國家衛生計生委衛生和計劃生育監督中心審核，并在國家衛生標準網公示，廣泛征集意見和建議。

2017年國家衛生和計劃生育委員會發布通告（國衛通[2017]11號）公告《裂頭絳蟲幼蟲檢測技術》（WS/T571-2017）衛生行業標準將于2018年2月1日起施行。這個標準填補了魚類、蛙類等水產品中的裂頭蚴檢測標準的空白，為相關水產品生產企業提供安全質量控制標準，為疾病控制和檢測機構提供檢測規范，從源頭上控制了裂頭蚴病的感染，保障了人民的身體健康。

2 標準正文內容

本標準規定了裂頭絳蟲幼蟲檢測技術的操作流程，主要涉及樣本種類、樣本采集、裂頭蚴形態學檢測方法、裂頭蚴分子生物學檢測方法、形態學鑒定結果的判定、PCR結果的判定、檢測需要試劑的配制等內容。

2.1 適用范圍

根據裂頭絳蟲幼蟲形態、寄生特點和生活史情況，明確規定了本標準適用于各級疾病預防控制機構、醫療機構和食品檢測機構對魚、蛙和蛇中裂頭絳蟲幼蟲的檢測。

2.2 規范性引用文件

2.3 術語和定義

明確了裂頭蚴、曼氏裂頭蚴、闊節裂頭蚴的定義并作出解釋。

2.3.1 裂頭蚴（plerocercoid larvae）指裂頭絳蟲的幼蟲，是假葉目（Pseudophyllidea）、裂頭科（Diphyllobothriidae）絳蟲第三期幼蟲的總稱。

2.3.2 闊節裂頭蚴（plerocercoid larvae of Dibothriocephalus latus 或phyllobothrium latum）指寄生在魚體內闊節裂頭絳蟲的第三期幼蟲。

2.3.3 曼氏裂頭蚴（lerocercoid larvae of Spirometra mansoni）指寄生在蛙、蛇或人體內曼氏迭宮絳蟲的第三期幼蟲。

2.4 儀器器材

規定了裂頭蚴幼蟲檢測過程中所有需要的儀器和實驗器材明細。體視顯微鏡和生物顯微鏡用于裂頭蚴的形態學鑒定；PCR擴增儀、凝膠成像儀、電泳儀用于核酸鑒定實驗的必用儀器設備；超凈工作臺是保證實驗結果正確性的必須的實驗環境；離心機和解剖手術器械是整個實驗用到的器材和設備。

2.5 試劑材料

對裂頭蚴幼蟲檢測過程中所有涉及的試劑、引物及陽性對照進行了規定，保證實驗結果的正確性。包括了胃蛋白酶消化液、擴增裂頭蚴核糖體DNA轉錄間隔區（ITS）引物序列；擴增裂頭蚴細胞色素C氧化酶（Cox1）引物序列；闊節裂頭蚴特異性引物序列及曼氏裂頭蚴特異性引物序列；陽性對照為裂頭絳蟲相應基因片段的陽性克隆質?；蛄杨^蚴、裂頭絳蟲全基因組DNA。

2.6 檢測步驟

此為整個標準的核心。標準規定了樣品準備、檢測具體操作步驟，介紹了壓片檢查法、蛋白酶消化法和核酸檢測法的詳細操作步驟，在核酸檢測法中細化規定了取樣的方法、核酸的提取、PCR反應程序，詳細闡明了裂頭蚴的形態特征及結果判斷。

2.6.1 壓片檢查法 用手術剪對受檢的魚、蛙和蛇逐條/只進行解剖。取出內臟，將腹腔壁內膜刮下，觀察腹腔內壁表面，若有可疑白色點狀物，用手術剪或手術刀分離皮肉，用兩把小鑷子將肌肉撕開，取含有白色點狀物的組織用載玻片壓片，用生物顯微鏡鏡檢判定結果。

2.6.2 蛋白酶消化法 稱取樣品250 g并剪成小塊，按樣品與胃蛋白酶消化液1：5 的比例加入消化液，37℃消化至無肉眼可見的肉組織為止。消化后用0.8 mm×0.8 mm（10目）網篩過濾，濾液置于尖底量筒內，加水（用水參照 GB/T 66828）至最大刻度處，沉淀洗滌至水清，全部沉渣置平皿，用體視顯微鏡鏡檢判定結果。

2.6.3 核酸檢測法 首先對取樣進行了詳細規定，第一步，在體視顯微鏡下挑取蟲體，初步鑒定后備用。第二步，按照總體積25 μl, 模板 DNA2 μl，上下游引物（10 μmol/L）各 0.5 μl，dNTPs 2 μl，MgCl22.5 μl，10× 緩沖液 2.5 μl，Taq 酶 （5 U/μl） 0.2 μl，補 充ddH2O至25 μl的反應體系，第三步，按照94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min ，35個循環；72℃延伸7 min的PCR反應程序，第四步，進行電泳取10 μl產物與2 μl的6×加樣緩沖液混合，加樣于含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中。在1×TAE緩沖液中，3～4 V/cm電泳約30 min，當溴酚藍到達底部時停止電泳，用凝膠成像系統分析。

2.6.4 結果判定 （1）裂頭屬的裂頭蚴判定 若從魚體內檢出的幼蟲大小長 2～20 mm，寬 2～3 mm，乳白色，頭節呈匙形，其背腹面各有一條窄而深凹的吸槽，體前端有凹陷且稍大，體不分節但具有橫皺褶，尾部細，呈棍棒狀，具有與成蟲相似的頭節，可初步判定裂頭屬的裂頭蚴。（2）迭宮屬的裂頭蚴形態判定 若從蛙或蛇體內檢出的幼蟲大小長 0.5～80 cm，寬 0.3～1 cm，長帶形，乳白色或淡黃色，蟲體前端無吸槽，頂端中央有一孔向內凹陷成隧道狀，并向后延伸形成盲管，蟲體不分節，具有不規則的皺褶，可初步判定為迭宮屬的裂頭蚴。（3）核酸擴增結果判定目的基因擴增片段出現條帶而空白對照未出現條帶，實驗結果成立；闊節裂頭蚴特異引物擴增，出現428 bp的特征條帶，初步判定該蟲種為闊節裂頭蚴；曼氏裂頭蚴特異引物擴增，出現156 bp的特征條帶，初步判定該蟲種為曼氏裂頭蚴；若要進一步對幼蟲定種，需將引物擴增產物進行測序，將其序列與GenBank上序列進行比對后定種。

3 標準附錄內容

標準有2個資料性附錄（A、C）和一個規范性附錄（B）組成。

3.1 附錄 A

附錄A 為關于裂頭蚴的病原學資料，主要介紹了闊節裂頭蚴和曼氏裂頭蚴的形態特征，闡述了闊節裂頭絳蟲和曼氏迭宮絳蟲的生活史[1]。

3.2 附錄 B

附錄B 為與檢測相關的技術方法的技術性資料，主要把檢測相關的試劑配制、裂頭絳蟲引物的模板、DNA的提取方法及相關試劑代碼的解釋，都細化列出，保證檢測過程的完整、正確、有效。

3.3 附錄 C

附錄C 為資料性附錄，附上了在魚肉中闊節裂頭蚴的彩色圖片，及來自蛙、蛇體中取出的曼氏裂頭蚴的圖片，以方便檢測人員在檢測過程中的比對辨認。

4 標準實施和宣貫重點

近年來，各種海產品大量投放市場，食用生魚片人數劇增，食用生三文魚、鱒魚等海魚感染裂頭絳蟲的人數也逐年增多。飲食習慣的改變，使得人們食用食品的種類百花齊放，涼拌蛇皮、快炒蛙肉等，也造成了曼氏裂頭蚴病劇增。如何從源頭上杜絕或減少裂頭蚴病的發生，《裂頭絳蟲幼蟲檢測》標準為檢驗檢疫、食品檢測機構提供了標準的檢測方法，保證水產品的安全。在標準實施和宣貫中要注意幾個重點：一是加強對裂頭蚴感染率高的國家周圍海域進口的海魚的檢驗檢疫，如，日本；以及對在海魚洄游產卵的江河捕獲的魚加強檢測，如，我國東北松花江的鱒魚；二是嚴管市場捕獲的野生蛙、蛇在市場的流放，加強農業部門檢測機構對這些兩棲類動物的檢疫；三是加強檢驗檢疫部門及食品加工企業的宣傳與培訓，使之能及時發現檢出裂頭蚴；四是加強人群的健康教育，不生吃或半生食魚類、蛙等水產品，改變不良的飲食習慣，提高自我保護意識。五是加強疾控醫療機構的宣傳培訓，及時發現患者，及時得到治療。