規范瘧原蟲檢測 助力瘧疾消除—《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》標準編制背景與解讀

王善青 周曉農

1 制定《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》的意義和必要性

血涂片染色法檢測技術是目前國內外通用的最直接、最重要的瘧原蟲檢測方法和瘧疾病例確診依據。血涂片鏡檢法既是世界衛生組織推薦的瘧原蟲檢測金標準，也是我國瘧疾診斷標準中推薦的主要檢測技術。世衛組織建議，在進行抗瘧治療之前，要對所有瘧疾疑似患者通過顯微鏡或者瘧疾快速診斷檢測法（RDT）及時作出寄生蟲學診斷[1]。光學顯微鏡要求在患者血液的厚涂片或者薄涂片中看到瘧原蟲。2016年6月1日起實施的《瘧疾的診斷》標準（WS-259-2015）中，在實驗室檢查中的第一條就是顯微鏡檢查血涂片查見瘧原蟲[2]。目前，國內外檢測瘧原蟲的主要方法就是“血涂片染色鏡檢法”。通過鏡檢方法檢測的瘧疾患者數量在2014年全球上升到2.03億。印度在這一全球總量中占據主導，所做的載玻片檢查達到1.2億份以上。在非洲區域，通過顯微鏡得到檢查的患者人數由2010年的3 300萬增加到2014年4 800萬[3]。鏡檢診斷檢測可加強對發熱患者中瘧疾患者的篩查和管理，也可能有助于通過僅在確診患者身上使用抗瘧疾藥而減輕耐藥性的出現和擴散。

血涂片染色后用顯微鏡檢測瘧原蟲是我國基層醫療機構和疾控部門最直接也是最常用的檢測方法[4]。血涂片顯微鏡檢查瘧原蟲是醫學上一種比較常見的方法，并且這種方法在對瘧原蟲的檢查上運用的非常廣泛，對于瘧疾患者的及時診斷有著很大的臨床價值。血涂片鏡檢瘧原蟲也是檢驗科的基本技能之一[5]。由于我國目前對于顯微鏡血涂片檢測瘧原蟲技術只有指南，而沒有規范標準。各地在實際操作過程中很難做到統一標準，基層醫療衛生工作者在開展顯微鏡血涂片法檢測瘧原蟲時隨意性很大，血涂片的制作既不規范也不統一。近年來，由于我國本地瘧疾病例的減少和消除，導致許多基層醫院和疾控機構不再重視瘧疾血涂片的鏡檢工作，使好多年輕的檢驗工作者不會制作血涂片，不認識瘧原蟲，導致基層檢測人員的血涂片鏡檢水平不斷下降[6-8]，甚至各級疾控機構鏡檢人員瘧原蟲監測檢測能力和意識也有所下降，這將會導致部分瘧疾患者漏診和誤診[9]，因為瘧疾的早期準確診斷對于有效的疾病管理和瘧疾監測至關重要，如果沒有規范的顯微鏡血涂片法檢測瘧原蟲技術標準，將直接影響到目前我國正在開展的消除瘧疾工作中的病例診斷和發熱患者的監測。因為誤診會引起大量發病和死亡，高質量的瘧疾診斷在各種情況下都很關鍵。因此，制定《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》這一標準，是為我國各級醫療機構從事臨床瘧疾病原學檢驗人員和疾控機構從事瘧疾監測實驗室人員提供一個統一規范的操作流程和技術規范。該標準的制訂對我國消除瘧疾以及消除瘧疾后的監測工作具有十分重要的意義。鏡檢瘧原蟲仍是目前瘧疾診斷的金標準，是發現瘧疾病原的主要手段，也是當前防治和消除瘧疾工作中的關鍵技術之一[10]。2010年，原衛生部等13部委聯合印發了《中國消除瘧疾行動計劃2010-2020》[11]，確定了到2020年全國實現消除瘧疾的目標，并對各級疾病預防控制機構開展瘧原蟲血檢比例、實驗室檢測率和實驗室確診比例等指標作了明確規定。為進一步提高全國疾控機構專業技術人員寄生蟲病防治理論水平與檢測技能，提高各地重點和常見寄生蟲病防治能力，國家衛生計生委疾控局每年都要舉辦全國寄生蟲病防治技術競賽，其中一項重要內容就是血涂片制作、染色及鏡檢操作等技能。有了標準，全國就有了統一的規范和要求，對人員培訓、考核與評價也就有了依據。

2 血涂片鏡檢法檢測瘧原蟲的優勢與條件

光學顯微鏡的優點是在患者血液的厚涂片或者薄涂片中可以直接看到瘧原蟲。顯微鏡使人能夠辨認不同的致瘧寄生蟲（惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲）、寄生蟲不同時期（包括配子體），以及對寄生蟲密度進行定量，以監測治療效果。顯微鏡是對瘧疾治療失敗情況作出調查的首選方法。吉姆薩染色是顯微鏡檢測瘧原蟲所用的傳統染色方法，要對同一患者的薄血膜和厚血膜進行檢查才可做出診斷。血涂片鏡檢法是從傳統角度對其它診斷方法進行衡量的診斷標準，所以說目前仍然是瘧疾診斷的金標準。

對瘧疾實行寄生蟲學診斷檢測可以加強對發熱疾病患者的管理，特別是有助于發現需要不同治療方法的非瘧疾患者。使用這種檢查方法可以僅在確診患者身上使用抗瘧藥，從而有助于減少耐藥性的出現和擴散。寄生蟲學診斷的優勢取決于醫療機構是否在管理患者時遵循檢查結果。在可以及時進行高質量的寄生蟲學診斷，而且沒有嚴重疾病征兆時，抗瘧藥治療應該僅限于檢查結果呈陽性的病例，而陰性病例則考慮其它發熱病因。

雖然顯微鏡仍然是多數大型醫療診所和醫院作出寄生蟲學診斷的支柱，但顯微鏡診斷的質量常常在確保瘧疾診斷的良好敏感性和特異性方面存在不足，這對健康結果和最佳治療方案帶來了負面影響。可接受的顯微鏡檢測應該既符合成本效益，又可以一直得出準確并且足夠及時的結果，以對治療帶來直接影響。這就需要有全面并且運作良好的質量保證規劃[3]。瘧疾鏡檢方面的有效質量管理體系要求有：（1）對質量保證進行監督的中央協調員；（2）在國家級和省級層面有一支顯微鏡學家參考（核心）小組，并得到外部質量保證規劃的支持以及得到培訓和載玻片驗證方面的專門技能；（3）根據相關臨床機構所需能力建立起良好培訓系統；（4）定期開展再培訓并對能力進行評估/分級，同時得到經過驗證的參比成套載玻片（瘧疾載玻片銀行）的支持；（5）可持續的載玻片驗證系統，可利用良好的驗證結果來發現存在的總體不足，并具有一個解決績效不足問題的系統；（6）在所有層面實施良好監督；（7）對顯微鏡進行良好的供應管理和維護；（8）在所有層面具有清晰的標準操作程序；（9）將預算列入瘧疾病例管理資金并使其保持充足。

3 世界衛生組織的相關文件和手冊指南

世衛組織要求所有疑似瘧疾患者在接受抗瘧藥物治療前，應先進行實驗室檢查（顯微鏡血涂片檢查或瘧疾快速診斷試劑檢測）。世界衛生組織（WHO）在2010年出版的《瘧疾治療指南》（Guidelines for the treatment of malaria, Second edition，WHO，2010）中明確指出，血涂片染色法檢測瘧原蟲是瘧疾診斷基本方法[12]，在2013年版《普及瘧疾診斷檢測-操作手冊》（Universal access to malaria diagnostic testing：an operational manual，WHO，2011，rev.2013）中，不但將顯微鏡血涂片染色法檢測瘧原蟲列為兩個基本診斷檢測方法之一（另一個是RDT），而且還列出了顯微鏡的使用、維護與保養標準操作規程[13]。雖然RDT越來越多地用于瘧疾的診斷，特別是在沒有鏡檢能力的偏遠山區，但是，由于顯微鏡血涂片染色法檢測瘧原蟲具有直接成本低、能區分多種種型和計算原蟲密度等獨特優勢，RDT是無法取代的，由此，WHO和世界各國目前仍推薦顯微鏡血涂片染色法檢測瘧原蟲為瘧疾診斷檢測的基本方法，特別在消除瘧疾階段，WHO推薦顯微鏡血涂片檢測是發現病例的主要手段，并于2014年3月在日內瓦召開了“全球瘧疾項目專家咨詢會”專門討論了瘧疾鏡檢質量保證手冊的更新問題[14]，2015年又出臺了厚薄血膜用于瘧原蟲的發現、診斷和計數的顯微鏡使用手冊[15]，指導世界各地瘧疾流行區的瘧原蟲顯微鏡檢測工作。

4 血涂片鏡檢在檢驗人員全面素質培訓中的重要性

隨著各類儀器在檢驗工作中的應用，儀器操作簡便、準確度高、誤差小等優點越來越被廣大檢驗工作者所青睞，也越來越依賴這些儀器。再加上現在工作量大，費時、費力的各種手工操作技術被忽略，而血涂片鏡檢就是各種手工操作技術中最基礎的一項，也是考察檢驗工作者全面素質最標準的一項。而這些手工操作技術是很多儀器不能代替的，并且在其它血液檢測標本預處理時也用的上[16]。為了加強血涂片鏡檢等檢驗基本操作技術，國家每年組織一次全國寄生蟲基本操作技能比賽，引導著全國各地從事寄生蟲檢驗（包括瘧原蟲檢測）的人員學習推片、白細胞計數、觀察各種寄生蟲的形態等，使許多年輕同志熟練掌握了血涂片鏡檢的各種操作技術，提升了檢測人員的全面素質。由于各類儀器的局限性，均不能對瘧原蟲的形態、分類及蟲種等作出辨認，只能作為一種初篩手段。而血涂片鏡檢由于是在顯微鏡下直觀觀察，能提高對瘧疾的診斷準確度，更好地服務于臨床，服務于患者。各級醫院應高度重視血涂片鏡檢工作，制定完善的制度。同時做好檢驗工作者全面素質的培訓，提高檢驗工作者服務于臨床的基本操作技能[17]。

5 對可能引起誤解的指標的解釋

（1） 厚血膜的直徑應為0.8～1 cm 還是1～1.2 cm，標準中規定的是直徑0.8～1 cm，主要依據一是2015年11月16日發布的《瘧疾的診斷》（WS259-2015）規范性附錄中已有明確要求，二是現場調研時征求了縣鄉兩級瘧疾檢驗人員的意見，認為直徑0.8～1 cm的厚血膜是合適的。

（2） 厚血膜一天內染色無需溶血,“一天”是否應改為“24小時”，經專家會議討論和現場調研了解，大家一致認為厚血膜溶血雖然有時間要求，但是不用精確到小時，為了便于基層人員掌握，以“一天”的描述方式較為合適。

（3）制作薄血膜時，載玻片與推片保持25°～35°角還是30°～45°角推開血膜，本標準中規定的是載玻片與推片保持25°～35°，主要依據一是2015年11月16日發布的《瘧疾的診斷》（WS259-2015）規范性附錄中已有明確要求，二是現場調研時征求了縣鄉兩級瘧疾檢驗人員的意見，認為載玻片與推片保持25°～35°是合適的。

（4）關于是否要增加“諾氏瘧原蟲”這個問題，起草組專家進行了認真的討論，最后一致認為，盡管目前國外（特別是馬來西亞和一些東南亞國家）有不少人感染“諾氏瘧原蟲”的報道，國內也有檢測到個別“諾氏瘧原蟲”感染病例，但是，目前國際社會仍以四種人體寄生蟲為主，尚未把“諾氏瘧原蟲”正式納入，另外，本標準在術語的定義中表述的已經比較清楚，將其納入“等”的范圍。