熒光定量PCR檢測宮頸癌患者血清中miR-203表達(dá)水平價(jià)值分析

miR-203是一種特異性皮膚miRNA，其可以對胚胎期的表皮分化、皮膚保護(hù)層構(gòu)建進(jìn)行參與和調(diào)控，且與牛皮癬、銀屑病等皮膚性疾病有關(guān)，能夠作為致癌或抑癌因子參與癌細(xì)胞的分化增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及凋亡中[1]。相關(guān)研究表明，miR-203發(fā)生異常表達(dá)主要與結(jié)腸癌、食管癌、白血病（慢性粒細(xì)胞）、前列腺癌等腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展有關(guān)。宮頸癌是一種婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率均較高。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及其疾病轉(zhuǎn)歸較為復(fù)雜，是對基因調(diào)控異常的一個過程。宮頸癌患者的腫瘤細(xì)胞中沉默表達(dá)或低表達(dá)的抑癌性miRNA能夠以其表達(dá)載體系統(tǒng)或類似物將外源miRNA導(dǎo)入，從而對腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)行抑制，預(yù)防和治療宮頸癌[2]。本文主要對熒光定量PCR在宮頸癌患者血清miR-203表達(dá)檢測中的應(yīng)用價(jià)值作分析，如下文。

1 資料與方法

1.1 基本資料

選取2016年1—12月宮頸癌患者60例作為實(shí)驗(yàn)組，同時選取良性宮頸疾病患者60例為對照組A，選取健康體檢女性60例作為對照組B，其均接受血清熒光定量PCR檢測。實(shí)驗(yàn)組中，年齡范圍為25～50歲，年齡均值為（38.51±1.20）歲；本組患者均經(jīng)病理診斷確診，臨床資料完整，且為初次治療的病例，將合并其他原發(fā)惡性腫瘤的患者排除。對照組A中，年齡范圍為24～51歲，年齡均值為（37.58±1.32）歲，其中子宮肌瘤患者21例，子宮內(nèi)膜增厚患者23例，子宮內(nèi)膜異位癥患者13例，其他疾病患者3例。對照組B中，年齡范圍為25～52歲，年齡均值為（38.01±1.36）歲。三組組受檢者進(jìn)行基本資料對比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 儀器、試劑 儀器主要包括紫外分光光度儀、高速冷凍離心機(jī)、低溫冰箱（-80℃）、7500 Real Time PCR System、PCR八連管；試劑主要為Trizol（DNA提取試劑）、逆轉(zhuǎn)錄試劑、DNA引物、miR-203與miR-let7、Maxima TM SYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）、TIANGEN普通型 miRNA、poly（A）尾、熒光定量試劑盒（KR201/FP401）、miRNA外參上游檢測引物（CD200）等。

1.2.2 標(biāo)本采集 通過真空管（分離膠）對受檢者的血液標(biāo)本進(jìn)行采集，并進(jìn)行離心處理，離心速度為每分鐘1 000轉(zhuǎn)，離心處理時間為10 min，之后取上清液置于EP管（含Rnase-free）中，在-80℃的溫度下保存。

1.2.3 提取血清RNA 采用RPE、RWT、QIAzol試劑和吸附柱對血清RNA進(jìn)行提取，將其溶于nuclease-free H2O（40 μl）中，采用紫外分光光度儀對RNA的純度和濃度進(jìn)行計(jì)算，并通過相關(guān)的模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.4 cDNA合成 將500 ng RNA、nuclease-free H2O等逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行混勻，并進(jìn)行離心處理，反應(yīng)條件是42℃下60 min，在70℃下為5 min，將獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放置于-20 ℃中進(jìn)行保存。

1.2.5 實(shí)施熒光定量PCR 其反應(yīng)的體系主要為5 μl cDNA，9 μl SYBR Green Ⅰ mix（Rox）、2 μl上游引物和 2 μl下游引物，合理對miR-203、miR-let7正向引物序列和反向引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，將RNnuclease-free H2O補(bǔ)足至20 μl，其反應(yīng)的條件是95℃下為10 min，之后95℃下15 s，在60℃下為60 min，共計(jì)40個循環(huán)，在60℃～95℃的條件下對熒光繪制的溶解曲線進(jìn)行收集。

1.3 觀察指標(biāo)

對三組受檢查者熒光定量PCR檢測的miR-203結(jié)果進(jìn)行觀察分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本文研究通過Ct值法進(jìn)行對比，取兩項(xiàng)平行反應(yīng)的均值Ct值，△Ct=Ct（miR-203）-Ct（miR-let7），基因相對表達(dá)量通過2-△Ct方法計(jì)算。所有資料用Graphpad Prism 5軟件實(shí)施統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析。

2 結(jié)果

miR-203的熔解度在79.56℃左右，內(nèi)參miR-let7熔點(diǎn)溫度在72.12℃左右，表示PCR參數(shù)設(shè)置合理，其逆轉(zhuǎn)錄引物以及擴(kuò)增物能夠?qū)iR-203以及內(nèi)參miR-let7片段擴(kuò)增出，非特異性產(chǎn)物對PCR檢查結(jié)果的相關(guān)影響較小，具有較高的特異度。

miR-203熒光定量PCR的反應(yīng)曲線主要為S型，其中實(shí)驗(yàn)組的Ct值均值為（17.21±2.02），對照組A的Ct值均值為（22.35±2.30），對照組B的Ct值均值為（23.10±2.18），實(shí)驗(yàn)組宮頸癌患者的Ct值明顯低于對照組A宮頸良性疾病患者和對照組B健康體檢女性（P＜0.05）。兩組之間的Ct值相比，差異較小（P＞0.05）。

3 討論

宮頸癌患者在疾病早期接受放射或手術(shù)治療，對改善其預(yù)后有著積極的意義。但是若患者存在淋巴結(jié)為轉(zhuǎn)移的情況，則臨床為其實(shí)施早期診斷時較易出現(xiàn)漏診的情況[3-4]。目前，對于淋巴轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測的方法主要為CT、PET-CT、MR等，但是其特異性和敏感性均較低[5-6]。

隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在血清中存在較多不同組織中的miRNA，有學(xué)者認(rèn)為miRNA可以作為一種潛在腫瘤標(biāo)志物，在淋巴細(xì)胞癌患者中，其血清miR-21、miR-210、miR-155等的表達(dá)量均明顯高于健康者[7]。大量研究證實(shí)miRNA能夠作為多種癌癥鑒別診斷的輔助手段，是患者病程監(jiān)測以及預(yù)后評價(jià)的標(biāo)志物[8]。膀胱癌、肺癌、胰腺癌等患者血清中的miR-203均處于高表達(dá)的狀態(tài)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，miR-203與miR20a與宮頸癌患者的疾病轉(zhuǎn)移、侵襲有著較為密切的關(guān)系，加強(qiáng)miR-203的檢測對宮頸癌患者疾病的診斷和預(yù)后的評估有著積極的意義。熒光定量PCR在miRNA檢測中應(yīng)用，具有敏感度高、快速簡便、特異度高等特點(diǎn)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，血清miR-203在宮頸癌患者疾病發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用，通過熒光定量PCR對miR-203進(jìn)行檢測，能夠?qū)m頸癌患者疾病的早期診斷和治療提供依據(jù)，意義重大。