線粒體蛋白表達(dá)與原發(fā)性膽汁性肝硬化病情進(jìn)展的相關(guān)性

楊小艷 張 旭 鐘玉全

線粒體蛋白表達(dá)與原發(fā)性膽汁性肝硬化病情進(jìn)展的相關(guān)性

楊小艷 張 旭 鐘玉全

目的探討線粒體蛋白對(duì)于原發(fā)性膽汁性肝硬化（PBC）病情進(jìn)展的診斷價(jià)值。方法收集120例PBC患者肝組織活檢標(biāo)本，其中60例為PBC初期破壞性膽管炎期，60例為PBC終末期肝硬化期，通過AST和ALT水平、免疫組織化學(xué)染色及小膽管與膽管量化分析，探究丙酮酸脫氫酶復(fù)合-E2（PDC-E2）、細(xì)胞色素C氧化酶亞型I（CCO）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3β（LC3）、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1與PBC病情進(jìn)展的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果PBC終末期小膽管區(qū)域的PDC-E2和CCO表達(dá)明顯高于PBC初期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。PBC終末期和初期患者膽管區(qū)域的PDC-E2、CCO、LC3、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。血清AST和ALT水平與兩種膽管的LC3的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.482、0.492、0.588、0.522，均P＜0.05），且與膽管內(nèi)p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.440、0.612、0.584、0.472，均P＜0.05）。結(jié)論小膽管的線粒體蛋白表達(dá)的情況也作為評(píng)估PBC疾病進(jìn)展的有效標(biāo)記物，與轉(zhuǎn)氨酶水平呈現(xiàn)正相關(guān)。

原發(fā)性膽汁性肝硬化線粒體蛋白進(jìn)展

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一種器官特異性的自身免疫性疾病，血清中存在抗中性粒細(xì)胞抗體是其典型特征[1]。目前肝移植是終末期PBC的主要治療手段，由于很多其他肝臟的疾患能導(dǎo)致局部的炎癥及膽管的破壞，組織學(xué)檢測(cè)復(fù)發(fā)性PBC通常較為困難。有研究顯示PBC膽道損壞的膽管上皮細(xì)胞能夠特異性地表達(dá)線粒體抗原、自嗜體及老化標(biāo)記物等，但不同病理階段其表達(dá)有可能不同，其在PBC的病理進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[2-4]。筆者針對(duì)不同病理階段的PBC患者，探究線粒體蛋白對(duì)PBC病情進(jìn)展的診斷價(jià)值，以期為臨床相關(guān)疾病的診療提供借鑒及指導(dǎo)。

1 對(duì)象和方法

1.1 肝組織標(biāo)本及處理本研究收集本院2011年3月至2015年12月120例肝組織活檢標(biāo)本，其中60例診斷為PBC初期破壞性膽管炎期，60例診斷為PBC終末期肝硬化期。所有PBC患者均符合臨床、血清學(xué)及組織學(xué)診斷特征。肝組織標(biāo)本固定于10％中性甲醛溶液內(nèi)，每塊組織至少切片20張（厚度4μm），每隔5張選擇一張切片進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅、網(wǎng)狀蛋白及苔紅素染色，剩余切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)和患者知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)染色按文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，線粒體相關(guān)抗原為丙酮酸脫氫酶復(fù)合-E2（PDC-E2）和細(xì)胞色素C氧化酶亞型I（CCO）；自噬體標(biāo)記為微管相關(guān)蛋白輕鏈3β（LC3）；失調(diào)的自噬體標(biāo)記p62及老化標(biāo)記p16NK4a和p21WAF1/Cip1。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，將切片與一抗在4℃環(huán)境下過夜孵育，之后添加Envision溶液，室溫靜置30min，通過過氧化氫及3-3′二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽使反應(yīng)物可視化。將切片輕微通過甲基氯或蘇木精進(jìn)行復(fù)染色；一抗選擇使用相同稀釋度的小鼠或兔的免疫球蛋白G，進(jìn)行組織學(xué)分析。研究中所使用的一抗分別為：PDC-E2（1∶100，Santa-Cruz）；CCO（1∶200，Invitrogen）；LC3（1∶50，Santa-Cruz）；p62（1∶1 000，MBL）；p16NK4a（1∶100，Neomarkers）和p21WAF1/Cip1（1∶100，BD transduction）。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果量化本研究中標(biāo)本切片關(guān)注的區(qū)域主要為小膽管（室間隔及小葉間膽管）及膽管（肝門附近區(qū)域內(nèi)徑較大的膽管），通過量化評(píng)分評(píng)估小膽管及膽管的免疫組織化學(xué)標(biāo)記物的表達(dá)程度。小膽管的免疫組織標(biāo)記評(píng)分為：0分（陰性），1分（少于3處的小膽管可見陽性細(xì)胞），2分（超過3處的小膽管可見廣泛存在的陽性細(xì)胞）；膽管的免疫組織標(biāo)記評(píng)分為：0分（陰性），1分（少于1/3門靜脈可見陽性細(xì)胞），2分（超過1/3門靜脈可見廣泛存在的陽性細(xì)胞）。記錄每個(gè)標(biāo)本得分?jǐn)?shù)。

1.4 AST、ALT與線粒體蛋白的相關(guān)性檢測(cè)所有PBC患者血清AST、ALT水平，分析其與線粒體蛋白表達(dá)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件；計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman分析AST、ALT與線粒體蛋白的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 小膽管各標(biāo)記物表達(dá)情況PBC終末期患者小膽管的膽管上皮細(xì)胞PDC-E2呈顆粒狀及泡狀高密度表達(dá)；而在發(fā)病初期患者中小膽管內(nèi)則未見PDC-E2的明顯表達(dá)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CCO兩者均有表達(dá)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PBC終末期患者中小膽管可見LC3及p62的結(jié)節(jié)性表達(dá)，同樣的表達(dá)可見于初期患者的標(biāo)本內(nèi)，且兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。p16INK4a及p21WAF1/Cip1僅見于兩組部分患者的小膽管內(nèi)，兩者表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1和圖1（見插頁）。

表1 兩種病變切片中小膽管區(qū)域各標(biāo)記物的表達(dá)情況比較[例（％）]

2.2 膽管各標(biāo)記物表達(dá)情況PBC終末期及初期患者PDC-E2、CCO、LC3、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

2.3 血清AST和ALT水平與標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)性分析血清AST和ALT水平與兩種膽管的LC3的表達(dá)均呈正相關(guān)（均P＜0.05），同樣的相關(guān)關(guān)系亦可見于膽管內(nèi)p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達(dá)，但其余指標(biāo)的表達(dá)與血清AST和ALT水平無相關(guān)性，見表3。

3 討論

有研究報(bào)道證實(shí)PBC受損的小膽管的膽管上皮線粒體蛋白的表達(dá)增加，并且可能與自噬體的失調(diào)有關(guān)[6-8]。本研究與之不同在于研究中納入了PBC早期及終末期患者標(biāo)本，本研究證實(shí)了線粒體蛋白（PDC-E2和CCO）的表達(dá)在終末期PBC肝臟內(nèi)的小膽管內(nèi)更為顯著，提示其可能被用來作為終末期PBC診斷的標(biāo)記物。

表2 兩種病變切片中膽管區(qū)域各標(biāo)記物的表達(dá)情況比較[例（％）]

表3 血清AST和ALT水平與標(biāo)記物表達(dá)的相關(guān)性分析

本研究也清晰地展示出了小膽管內(nèi)PDC-E2和CCO的表達(dá)可作為終末期PBC的有效診斷標(biāo)記物，小膽管線粒體蛋白的表達(dá)與臨床及組織學(xué)診斷PBC終末期一致。與之相對(duì)應(yīng)的，若小膽管無上述兩種蛋白的表達(dá)而存在LC3、p62、p16INK4或者p21WAF1/Cip1的表達(dá)，則通常相應(yīng)的診斷為PBC初期，由于兩者組織病理學(xué)檢查中均可見典型的膽管損害，因此兩者的區(qū)分存在一定的困難[6,9-12]。雖然一般認(rèn)為切片中顯示的膽管的肉芽腫病變即視為PBC的跡象，但實(shí)際中發(fā)現(xiàn)的概率僅為30％左右。少數(shù)文獻(xiàn)就相關(guān)的診斷標(biāo)記物進(jìn)行過探究，一項(xiàng)研究表明PBC初期上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)化可能參與了膽管的損害過程；肝移植中就PDC-E2表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測(cè)的結(jié)果參差不齊，為此本研究提供了相關(guān)證據(jù)，但仍需要大樣本的病例進(jìn)行深度確認(rèn)。

本研究發(fā)現(xiàn)很多診斷為PBC初期的標(biāo)本小膽管內(nèi)通常可見LC3、p62、p16INK4a或p21WAF1/Cip1的表達(dá)，而線粒體蛋白的表達(dá)通常很低。部分研究主要關(guān)注于小膽管內(nèi)p16INK4a或p21WAF1/Cip1的表達(dá)，PBC初期中后者的表達(dá)與膽管上皮的老化相關(guān)；在慢性同種異體肝排異及PBC內(nèi)，兩者均表現(xiàn)為肝內(nèi)膽管的進(jìn)行性缺失，據(jù)報(bào)道膽管上皮的老化是最主要的機(jī)制之一[13-15]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了在PBC初期中存在小膽管的膽管上皮的老化。

本研究還發(fā)現(xiàn)PBC初期患者中小膽管多表現(xiàn)LC3和/或p62的表達(dá)，而PBC標(biāo)本中各種標(biāo)記物的表達(dá)概率相對(duì)較高。有研究報(bào)道在PBC的膽管上皮內(nèi)自噬體通常先于細(xì)胞的老化，體外的研究亦報(bào)道氧化應(yīng)激、饑餓及疏水性膽汁酸等能夠誘導(dǎo)自噬體及膽管上皮的自噬體失調(diào)[16-20]。本研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物在PBC兩種病理改變時(shí)期中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此筆者設(shè)想其中相關(guān)的病理變化過程亦是不同的。

研究結(jié)果顯示AST和ALT水平與兩種膽管的LC3的表達(dá)顯著相關(guān)，同樣的相關(guān)關(guān)系亦可見于膽管內(nèi)p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表達(dá)，但相關(guān)的機(jī)制仍不清楚，可能的推測(cè)為嚴(yán)重的肝臟損傷可導(dǎo)致干細(xì)胞及膽管上皮自噬體的失調(diào)改變。

綜上所述，本研究初步證實(shí)小膽管的線粒體蛋白表達(dá)可作為PBC終末期的有效診斷標(biāo)記物。

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ObjectiveTo investigate the association between the exp ression of m itochond rial p roteins and the p rogression of p rimary biliary cirrhosis(PBC).MethodsBiopsy specimens were taken from 120 PBC patients,inc lud ing 60 cases of early stage and 60 cases of end stage.Serum AST and ALT levels were measured,and the exp ressions of pyruvate dehyd rogenase-E2(PDC-E2),cytochrome c oxidase isoform I(CCO),m icrotubule-associated p rotein light chain 3β(LC3), p62,p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in tissue sam p les were detected by immunohistochem ical staining.The correlation between the exp ression ofm itochond rial p roteins and the p rog ression of PBC was analyzed.ResultsThe exp ression of PDC-E2 and CCO in the smallbile ductarea ofend stage PBC was significantly higher than that in the early stage PBC(all P＜0.05).However, there were no significantdifferences in the exp ression of PDC-E2,CCO,LC3,p62,p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in the bile duct between end-stage and early stage PBC(all P＞0.05).The serum levels of AST and ALT were positively correlated w ith the exp ression of LC3(r=0.482,0.492,0.588,0.522,all P＜0.05)in smallbile duct and bile duct,and correlated positively w ith the exp ression of p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in the bile ducts(r=0.440,0.612,0.584,0.472,all P＜0.05).ConclusionThe exp ression ofm itochond rialp roteins in smallbile ducts is positively correlated w ith serum transam inase levels,which may be an usefulbiomarker for the d isease p rog ression of PBC.

Primary biliary cirrhosis Mitochond rialp rotein Prog ressing

2016-07-19）

（本文編輯：陳麗）

641000四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科

楊小艷，E-mail：xiaoyyang1981@163.com