東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)質(zhì)量控制管理

張松玲，何威，王強(qiáng)，李勝男，路曉玉

1.吉林省生物研究所生化研究室，吉林長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春市中醫(yī)院腦病科，吉林長(zhǎng)春 130000；3.吉林省生物研究所羊草研究室，吉林長(zhǎng)春 130012

東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)質(zhì)量控制管理

張松玲1，何威2，王強(qiáng)1，李勝男1，路曉玉3

1.吉林省生物研究所生化研究室，吉林長(zhǎng)春 130012；2.長(zhǎng)春市中醫(yī)院腦病科，吉林長(zhǎng)春 130000；3.吉林省生物研究所羊草研究室，吉林長(zhǎng)春 130012

目的 探討分析東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)，并對(duì)其質(zhì)量控制進(jìn)行分析研究。方法 該文對(duì)東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行分離和純化，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)所需要的條件及試劑進(jìn)行比較優(yōu)化，對(duì)東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代。結(jié)果 通過(guò)上述分離方法分離獲得林蛙輸卵管上皮細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色看出活細(xì)胞達(dá)95%以上，分離方法可行。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離所得的輸卵管細(xì)胞為圓餅狀，胞漿飽滿(mǎn)，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，呈懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞大部分都處于貼壁狀態(tài)，多數(shù)伸展呈卵圓形，類(lèi)似眼睛狀，成簇生長(zhǎng)，排列緊密，7 d后長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶瓶底，開(kāi)始傳代培養(yǎng)。結(jié)論 該研究建立的東北林蛙原代輸卵管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法可獲純度較高的輸卵管上皮細(xì)胞，值得實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)質(zhì)量控制管理。

東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；質(zhì)量控制

東北林蛙是生長(zhǎng)在東北山區(qū)的純野生動(dòng)物，是集藥用、食補(bǔ)、美容功能于一體的珍稀兩棲類(lèi)動(dòng)物。東北林蛙是食、藥兩用的珍貴蛙種，由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，俗稱(chēng)“大補(bǔ)品”，林蛙油自古以來(lái)被認(rèn)為是滋補(bǔ)強(qiáng)壯劑，可補(bǔ)虛強(qiáng)精壯陽(yáng)，養(yǎng)肺滋腎益肝。可治療腎虧勞損、神經(jīng)衰弱、心慌失眠、溢汗不止、身體虛弱等一切消耗性疾病[1]。林蛙皮具有抗癌、抗炎、保濕、美容等。林蛙卵具有調(diào)節(jié)血脂、抗疲勞、抑制中樞神經(jīng)的作用。因此，合理開(kāi)發(fā)利用東北林蛙具有重要的意義。輸卵管作為輸送受精卵的場(chǎng)所，其上皮細(xì)胞為輸送精子、受精卵早期胚胎發(fā)育提供良好的材料[2]，針對(duì)東北林蛙獨(dú)有的藥用價(jià)值和天然的利用資源，其輸卵管上皮細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)。該文通過(guò)分離培養(yǎng)東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行作用質(zhì)量控制，建立了完整的東北林蛙細(xì)胞體外分離培養(yǎng)的方法，為今后進(jìn)一步研究東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化代謝、細(xì)胞因子研究等提供良好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該文選取20只東北林蛙均捕自吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)。均為產(chǎn)卵前雌性林蛙。

1.2 主要試劑

培養(yǎng)基DMEM/Hanks液是sigma公司產(chǎn)品，加0.005 7 g青霉素1 750 U/mg，0.05 g鏈霉素100 mg/L，50 mL胎牛血清（37℃水浴至融化），調(diào)節(jié)pH為7.2～7.4，0.22 μm濾膜過(guò)濾后使用，4℃保存。10%～15%胎牛血清(FCS)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司，滅活后使用。胰蛋白酶是sigma公司產(chǎn)品，用D-Hanks液配成0.25%濃度。調(diào)節(jié)pH為7.2～7.3。DMSO購(gòu)于sigma公司。

1.3 東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的分離質(zhì)量控制管理

首先處死林蛙，在無(wú)菌環(huán)境下迅速取出林蛙輸卵管，剪下輸卵管壺腹部放入于滅菌小平皿中，用含青鏈霉素的D-Hank’s液漂洗2～3次，清洗掉血液組織后用組織剪進(jìn)行剝離，去掉周?chē)尺B的組織，分離出完整的輸卵管。然后迅速剪碎輸卵管，加入適量 0.25%胰蛋白酶，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)消化30 min，加入含15%血清DMEM培養(yǎng)液終止消化。消化過(guò)程中要吹打數(shù)次以便內(nèi)膜消化充分。然后裝入離心管內(nèi)，800 r/min離心10 min，棄上清。沉淀部分再用DMEM培養(yǎng)液漂洗2次，800 r/min離心10 min，棄上清。加入含15%血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活性并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，顯微鏡下觀察細(xì)胞活性大于95%即為活性良好。

1.4 東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)質(zhì)量控制管理

取上述細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×102個(gè)/mL接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液 3 mL，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3～4天 換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)板底層后，即進(jìn)行傳代。首先小心吸取培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用含青鏈霉素的D-Hank’s液漂洗2～3次，加入0.25%胰蛋白酶2 mL放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中消化5～10 min，顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞收縮變圓懸浮立即加入含15%血清DMEN培養(yǎng)液終止消化，800 r/min離心10 min，棄上清。加入含15%血清DMEN培養(yǎng)液，吹打制成懸液，然后調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/mL接種于新培養(yǎng)板中，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。定時(shí)換液并注意觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的凍存與解凍質(zhì)量控制管理

將上述經(jīng)胰酶消化的林蛙輸卵管上皮細(xì)胞一部分放入培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，另一部分制成單細(xì)胞懸液，用含10%DMSO和20%血清的培養(yǎng)液稀釋成細(xì)胞濃度為5×106/mL的混懸液，迅速加入冷凍管中，首先放入4℃冰箱中30 min，然后放入-20℃冰箱2 h，然后放入-70℃冰箱過(guò)夜后，放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

需要解凍時(shí)，將冷凍管從液氮中取出后迅速投入37℃溫水中。待細(xì)胞完全解凍后在無(wú)菌環(huán)境下將上清棄去，用培養(yǎng)液配置成細(xì)胞懸液，并用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，備用。

2 結(jié)果

2.1 東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞分離結(jié)果

通過(guò)上述分離方法分離獲得林蛙輸卵管上皮細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色看出活細(xì)胞達(dá)95%以上，分離方法可行。

2.2 東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離所得的輸卵管細(xì)胞為圓餅狀，胞漿飽滿(mǎn)，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，呈懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞大部分都處于貼壁狀態(tài)，多數(shù)伸展呈卵圓形，類(lèi)似眼睛狀，成簇生長(zhǎng)，排列緊密，7 d后長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶瓶底，開(kāi)始傳代培養(yǎng)。

3 討論

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的質(zhì)量控制管理

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)自誕生以來(lái)，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工程技術(shù)、基因工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)等領(lǐng)域，隨著現(xiàn)代醫(yī)藥的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在生物制品的開(kāi)發(fā)、生物大分子分析、臨床藥物開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用。細(xì)胞培養(yǎng)所用的細(xì)胞可以是分離純化的原代細(xì)胞，也可以是購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞株。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，由于實(shí)驗(yàn)室條件，細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)質(zhì)量控制的差異，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢、細(xì)胞株間交叉污染以及遺傳突變等風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大[3]。該研究從實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)試劑出發(fā)，研究細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量控制管理，為東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)提供良好的技術(shù)支持。

3.2 東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞質(zhì)量控制管理

該研究選取20只生長(zhǎng)在吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)的產(chǎn)卵前雌性東北林蛙。采用sigma公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)基和Hanks液，無(wú)菌環(huán)境下加入定量的青鏈霉素以及15%血清，并采用0.22 μm濾膜過(guò)濾，確保培養(yǎng)液的質(zhì)量。采用0.25%的消化酶分離純化林蛙卵上皮細(xì)胞，嚴(yán)格控制消化酶的濃度和消化時(shí)間，細(xì)胞胰蛋白酶消化法：該方法獲得較多的單細(xì)胞及體積較小的細(xì)胞團(tuán)塊，部分細(xì)胞形態(tài)不完整，一般在接種細(xì)胞在貼壁后增殖速度較慢，細(xì)胞懸液中細(xì)胞碎片較多，培養(yǎng)液較為黏稠。所以消化過(guò)程中要注意多次輕柔吹打，直至吹成單細(xì)胞懸液，防治形成的細(xì)小細(xì)胞團(tuán)塊影響貼壁及生長(zhǎng)[4]。并且嚴(yán)格控制離心機(jī)的離心轉(zhuǎn)速和離心時(shí)間，得到數(shù)量較多、活性較高的輸卵管上皮細(xì)胞。在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件，控制培養(yǎng)箱的溫度和CO2的濃度，濃度較高的胎牛血清是培養(yǎng)的關(guān)鍵，另外要注意培養(yǎng)瓶中接種濃度不可過(guò)密，培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)液要根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及時(shí)更換，在傳代培養(yǎng)時(shí)注意消化酶的濃度和消化時(shí)間，不可過(guò)度消化，影響細(xì)胞活性，最后需要注意的是無(wú)菌環(huán)境和操作技術(shù)，避免染菌[5]。凍存細(xì)胞時(shí)要注意遵循“慢凍快溶”的原則，嚴(yán)格把握冷凍階段時(shí)間，冷凍液的配置要注意DMSO和培養(yǎng)液的比例，注意防護(hù)液氮凍傷。質(zhì)量較好的試劑、良好的無(wú)菌操作環(huán)境和精良的操作技術(shù)是成功培養(yǎng)林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的關(guān)鍵。該研究結(jié)果顯示通過(guò)上述分離方法分離獲得林蛙輸卵管上皮細(xì)胞，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色看出活細(xì)胞達(dá)95%以上，細(xì)胞圓形，形態(tài)飽滿(mǎn)，分離方法可行。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分離所得的輸卵管細(xì)胞為圓餅狀，胞漿飽滿(mǎn)，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，呈懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞大部分都處于貼壁狀態(tài)，多數(shù)伸展呈卵圓形，類(lèi)似眼睛狀，成簇生長(zhǎng)，排列緊密，從形態(tài)學(xué)角度確定是林蛙輸卵管上皮細(xì)胞。該研究建立的東北林蛙原代輸卵管上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)方法可獲純度較高的輸卵管上皮細(xì)胞，為后續(xù)研究東北林蛙輸卵管上皮細(xì)胞的形態(tài)功能及東北林蛙體外胚胎共培養(yǎng)體系的建立提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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R3

A

1672-5654（2017）09（c）-0104-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.27.104

張松玲（1979-）,男，吉林長(zhǎng)春人，本科，副研究員，研究方向:保健食品開(kāi)發(fā)與細(xì)胞培養(yǎng)。

何威（1981-）,女，吉林長(zhǎng)春人，碩士，副教授，研究方向:中醫(yī)腦病，E-mail:297378127@qq.com。

2017-06-25）