藥品微生物檢驗實驗室質量控制影響因素分析

張國林

1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇蘇州 215000；2.南京中醫藥大學，江蘇南京 210000

藥品微生物檢驗實驗室質量控制影響因素分析

張國林1,2

1.蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，江蘇蘇州 215000；2.南京中醫藥大學，江蘇南京 210000

藥品微生物檢驗是藥品質量控制的重要環節，也是保障公共用藥安全的重要途徑。微生物檢驗結果是進行風險調查、風險評估和風險管理的重要參考指標，也是改善過程控制效果的重要依據。該文從藥品微生物檢驗標準、檢驗檢測方法、菌種與培養基、環境控制和儀器設備等方面闡述藥品微生物檢驗質量的影響因素。

微生物檢驗；質量控制；影響因素；風險評估；假陽性或假陰性

藥品微生物控制是藥品質量控制的重要環節，微生物檢驗結果是進行風險調查、風險評估和風險管理的重要參考指標[1-2]。不同于理化檢驗，微生物檢驗屬于活體檢驗，結果容易受到多種內外因素的影響，如檢驗環境、培養基質量、菌種活力等。2015年版中國藥典（以下稱 “新版藥典”）已經解決了與ICH協調案的協調問題，達到了一部、二部、三部通則的統一，實現了與國際標準的全面接軌，并強化了對藥品微生物檢驗中操作關鍵點的控制[3]，而關鍵點的控制正是藥品微生物檢驗實驗室質控的關鍵方面。在現代的GMP生產條件下，藥品微生物污染屬于小概率事件，且污染具有不均一性的特點，無法通過復試來確認結論，故目前各國法規均要求對異常結果（out of specification，OOS）進行有條件復試[4]。 因此，分析檢驗異常結果的來源、控制影響檢驗結果的因素顯得十分重要。探索影響微生物檢驗實驗室質量的相關因素，避免假陽性或假陰性的出現對提供準確、可靠結論、進行有效過程控制和風險管理具有重要的價值。該文從標準、檢驗檢測方法、菌種與培養基、環境控制和儀器設備等方面闡述藥品微生物檢驗的影響因素。

1 檢測標準與方法

確認標準與方法的現行有效是進行檢驗檢測工作的首要任務。目前國家食品藥品監督管理總局也制定了《藥品標準管理辦法》（目前為征求意見稿階段）來規范藥品標準的制定和修訂工作。藥品標準涉及國家標準、藥品注冊標準、各省級食品藥品監督管理部門制定的地方藥材標準、中藥飲片標準、醫療制劑標準、行業標準及國外標準等。標準與方法既要強調標準的科學性，也要統籌可操作性。新版藥典解決了與ICH協調案的協調問題，實現了與國際藥典的有效統一。同時，新版藥典對檢出控制菌的鑒定手段有了理念上的重大轉變，強調可根據實驗室特點進行微生物的鑒定。雖然未對方法進行統一規定，但對微生物實驗室的質量控制提出了更高的要求。藥品的生產工藝、檢驗方法以及相關的質量控制技術要求屬于藥品的通用技術要求，應當制定國家標準。同時，對于已批準上市生產的藥品國家標準應由國家藥品委員會對需要修訂的標準組織修訂。經過多年的改進，藥品微生物檢驗的標準與方法在不斷完善，微生物限度及無菌檢查的方法學驗證資料也在不斷充實，但在實際工作中仍碰到一些標準與方法在操作上的具體問題，舉例如下。

標準不明或不完善。在實際工作中曾接觸到乙醇的微生物限度檢查的委托檢驗，但生產企業無法提供具體的用途與檢驗檢測方法和標準，故在進行控制菌檢驗時將檢查項目確定為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。進行控制菌檢查時通常在供試液制備完成后應進行預增菌，然后進行選擇性培養基分離與鑒定，但實際工作中相關企業提供的方法學驗證資料中竟有采用平皿法進行控制菌檢查的實例。另外，進行中藥制劑的微生物限度檢驗時通常需要根據工藝處方的“制法”以確認是否進行大腸菌群或耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌（新版藥典）的檢查。通常情況下藥品標準里都包含“制法”，但部分品種中不包含此項。在無法及時獲得相關資料時，應采用從嚴標準進行檢測。當方法無法在特定的實驗室進行檢驗時，新版藥典提供了藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則，為微生物檢驗實驗室出于各種原因的如成本、生產量、快速簡便及提高質量等采用非藥典方法提供了依據。

樣品供試液均勻制備是取得準確、可靠檢驗結果的首要步驟。微生物限度檢查供試液制備的主要目的是將供試品中的微生物提取并盡量分散均勻。當供試品無法制備成均一溶液時，在制備供試液進行下一步檢查前應用力震蕩，使供試品中的微生物盡量分散均勻。對水不溶性供試品供試液的制備需根據樣品的特性采取合理的方法。如貼膏劑供試品無法制備成均一溶液，通常將其黏貼面上貼一層多孔紗布劇烈震蕩，盡量分散后再進一步試驗；進行敷料類供試品微生物限度檢查時應在無菌條件下將供試品剪成盡量的小塊再進行下一步操作。

進行薄膜過濾法檢查時抑菌性的消除程度是影響檢驗結果的關鍵因素因素，故需要對沖洗量、沖洗次數及流速等進行合理控制。合理的沖洗量一方面可以有效去除樣品的抑菌活性，同時也有利于對結果的準確判定。采用薄膜過濾法進行抗生素檢查是消除其抑菌活性的主要手段，但進行脂肪乳檢查時則主要考慮的是利于結果觀察。該研究在進行中長鏈脂肪乳無菌檢查時發現沖洗量相差100 mL時無菌濾筒中殘余中長鏈脂肪乳對最終結果的觀察影響差異非常明顯。薄膜過濾法沖洗量也不宜過大或過濾壓力過大，以避免造成微生物的活性下降甚至死亡或破壞濾膜的完整性。沖洗液的流速要合理控制，尤其是顆粒較大容易堵塞過濾孔的供試品，如中長鏈脂肪乳。若為增大過濾速度而增大蠕動泵的速率，則可能造成濾膜穿孔而造成結果的無效。藥品檢驗機構對同品種的批量檢驗供試品建立針對品種的可執行的SOP是有益的嘗試。

合理的陽性與陰性對照是保證檢驗方法準確和結果準確的重要手段。陰性對照可以有效地排除供試品以外的因素對結果造成的影響，而陽性對照是確保所采用的方法適合特定品種檢驗的需要。雖然目前美國藥典對無菌檢查的陽性對照無要求，但在目前接觸到的微生物檢查方法來看陽性對照是必須的。例如在進行抗生素檢驗后一旦溶解抗生素的容器清洗不徹底（雖然發生的概率極低），殘留的抗生素會影響下批次供試品中微生物的檢出。

2 潔凈操作環境

新版藥典對微生物檢查環境最終確定為“實驗環境應符合無菌檢查/微生物限度檢查的要求”，與2010年版中國藥典的論述有了一定的變化。考慮到檢驗環境應不低于生產關鍵區域環境的原則，為確保藥品檢驗實驗室檢驗結果的權威性，藥檢機構應將無菌檢驗的環境條件控制在B級背景的A級層流環境下，或采用無菌隔離器進行檢驗。

潔凈室設計、布局與性能確認。微生物檢測實驗室的設計和布局應考慮實驗設備的安裝、良好的微生物實驗室操作規范，避免環境對樣本的污染以及菌種之間的交叉污染，并防止有害生物因子污染環境。通常微生物限度室、無菌室、抗生素檢定室及陽性操作室應從空間上進行分離，防止相互之間交叉污染?；谏锇踩慕嵌?，陽性室空調直排系統應獨立設置，并維系與相鄰房間的負壓狀態。該研究在進行轄區內醫療器械生產企業潔凈環境監測時發現部分陽性潔凈室仍未設計為負壓，部分潔凈室雖然設計為負壓，但未選擇合適的負壓壓差表，造成壓差顯示不正確。潔凈區的墻壁、地面應光滑、平整無裂縫，接口嚴密，無顆粒脫落。建筑材料應利于清潔、消毒和滅菌，以減少污染的風險。潔凈區高效過濾器的額定風量與空調機組的性能相匹配，確保潔凈室內懸浮粒子濃度保持在較低的水平。由于微生物通常附著于懸浮粒子上，空調凈化系統的優劣也直接影響環境中微生物的控制效果。另外，除了陽性室應維持負壓外，不同潔凈度的潔凈室之間應保持合理的壓差梯度。

藥品微生物檢查潔凈區應定期進行清潔和消毒，并在日常使用過程中進行潔凈環境、表面微生物等的監測。由于潔凈環境與外部普通環境會有人員和物料的交流，通常無法保證絕對的無菌。現有的國家標準對不同潔凈度級別的環境微生物限度標準進行了相應的規定。國家標準通常為最低的要求，在日常的使用過程中要加強對潔凈區生物因子變化的趨勢性分析，并設立警戒限度和糾偏限度。在潔凈室風險評估與風險控制中，也要將統計學分析方法納入其中。統計學中通常將（x±2SD）設為警戒線，（x±3SD）設為行動線（糾偏限）。 陳偉盛等[5]通過對潔凈環境的監測數據進行統計分析，實現了對潔凈室的污染評估和風險控制，并設立了實驗室相應的警戒限。當環境監測結果超過警戒限度或糾偏限度時應采取相應的措施。同時，當環境微生物監測結果出現趨勢性變化時也應分析原因并采取相應的措施。雖然潔凈環境的控制能夠有效降低微生物污染的風險，但并不能完全排除。由于微生物污染發生的小概率性和不均一性特點，藥品微生物檢測過程中通常進行有條件的復試。因此，強化檢出菌的鑒定與溯源、排除外部環境因素對結果的影響顯得十分必要。目前藥檢系統已經開始逐步建立環境菌庫[1,6-10]，該研究也收集了近年來無菌檢查環境的微生物并初步建立的無菌檢查環境菌數據庫。

3 培養時間與計數

培養時間。藥品中微生物通常受到不同程度的損傷或抑制，活力相對較差，恢復生理狀態至長成肉眼可見的菌落需要一定的時間。中國藥典中規定需氧菌總數需培養3～5 d，霉菌和酵母菌培養5～7 d觀察。因此，為了使樣品中的微生物充分生長，需培養5d（需氧菌）或7 d（霉菌和酵母菌）。當需要時，要適當延長培養時間。但部分微生物在計數平板上會呈現蔓延式生長，影響最后的計數結果判定。為了避免蔓延生長造成的計數誤差，通常需要逐日觀察。但應當注意的是霉菌培養過程中若要觀察，應小心輕放，避免孢子分散后重新長出菌落影響結果。新版藥典的霉菌和酵母菌計數采用沙氏葡萄糖瓊脂培養基，其對細菌無明顯的抑制作用，但由于霉菌和酵母菌限度標準相對較低，因此當計數結果有異議時應加驗證量的抗生素重新進行計數確認。應當指出的是當進行計數的方法學驗證時應在藥典規定的最短時間內培養計數，即需氧菌總數培養3 d，霉菌和酵母菌培養5 d觀察。

微生物限度檢查通常采用不同稀釋級進行分別計數并進行結果分析。由于微生物在供試液中的分布特點導致其不同稀釋級的計數結果可能存在誤差，不完全一致。與以往藥典規定不同的是新版藥典要求取最高的平均菌落數進行報告。但應當指出，不同稀釋級計數結果存在較大的差異性時應首先分析造成的原因。例如當樣品存在較強的抑菌性而未完全消除時，最終高稀釋級的菌落計數會明顯多于低稀釋級的菌落數，造成結果判定的錯誤。新版藥典對通用的微生物限度標準規定為指數形式，如104 cfu可接受的最大標準為20 000 cfu。但對于品種項下的規定或限度標準中丸劑的3×104 cfu應為具體數值。

4 復試與重試問題

在現代GMP的生產條件下，藥品受到微生物污染是高度隨機的小概率事件。同時，樣品微生物污染也是高度不均一的。因此，當出現超標結果或結果異常時需要展開回顧性的質量調查。若可以排除外在的因素影響，則樣品不得復試。但是當分析發現操作過程中影響結果的人員、試劑、環境、方法等不符合規定時應進行調查分析，確定是上述因素引起的結果異常而非樣品本身原因時，應進行重試。

5 人員與儀器設備

隨著現代科技的發展，各種新型的儀器不斷出現，儀器在微生物檢驗工作中的重要性越來越得到體現[2]。檢測工作要使用計量檢定合格的儀器設備。但在實際工作中可能出現計量部門無法進行計量儀器，如全自動微生物生化鑒定分析儀。對計量部門當前無法計量的儀器，可以采用標準物質進行檢測分析判定其準確性，如全自動微生物生化鑒定分析儀可以采用標準菌株進行驗證確認。壓力滅菌器是培養基除菌的重要設備，也是影響檢驗結果、保證生物安全的重要設備。但高壓滅菌器性能不佳或使用不當會對結果造成誤差，如壓力滅菌器升溫緩慢會導致培養基過熱造成過度滅菌，破壞培養基的促生長能力。人員素質是微生物檢驗質量第一位的影響因素。從事微生物檢驗人員應具備微生物相關的基礎理論知識和試驗技能，應具有醫藥學相關的理論知識，并不斷接受新理論、新方法的技能培訓。由于微生物檢驗工作的特殊性，實驗人員應經過實驗室生物安全方面的培訓。對特定崗位人員從事新工作時需要進行考核和授權，以確認檢驗人員能夠適應新的崗位職責。同時，應定期組織開展人員比對、能力驗證、內審及使用標準菌株等以提高檢驗人員的綜合素質。對于人員的培訓、考核等均應記錄并歸檔。

6 培養基、菌種與生物安全

培養基是進行微生物檢測與分析的物質基礎，選擇合適的培養基品牌及制備和保存方法是提高檢驗準確性的重要措施。但目前市售的培養基質量參差不齊。培養基在使用前除進行外觀驗收（如顏色、是否結塊）外，應進行適用性檢查，以確認滿足特定用途要求。目前中國食品藥品檢定研究院已提供大部分藥品對照培養基供培養基適用性檢查實驗。但也有個別培養基未查詢到對照培養基的出售，如血平板。該研究認為對無法獲得對照培養基的培養基適用性檢查時可以采用標準菌株或典型菌株進行檢查，并可以與目前的主流品牌培養基或上批次在用進行比較。鑒于培養基對實驗結果的影響，培養基采購時應嚴格供應商資質審核，一旦確定后盡量避免不斷更換。新到貨培養基應進行外觀和技術性驗收（可參考SN/T1538和ISO/TS11133），確保培養基的質量。新版藥典中無菌檢查用的培養基由硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基并更為硫乙醇酸鹽流體培養基和TSB培養基。考慮到制藥用水中寡氧微生物的生長環境，新版藥典對純化水檢測培養基定為R2A。某些特定的培養基應采取適當的處理措施，如糖發酵培養基分裝容器一般進行預先滅菌；配置過程如需加熱助溶的應避免過度加熱，防止顏色變深、瓊脂凝固力或pH值改變；有添加成分時應按照使用說明書要求進行操作，并注意充分混勻。適宜的pH值是微生物生長所必須的條件，但培養基滅菌前后通常pH值會發生變化。因此，應確保每批培養基滅菌后在25℃條件下pH達到規定。瓊脂培養基不得進行反復融化，不得保存于0℃以下條件。另外，應密切留意培養基可能的殘留或其他狀態，如硫乙醇酸鹽培養基中的瓊脂可能會殘留結塊而影響無菌檢查最終結果的判斷。實驗室應制定相應的培養基質量控制程序，并對pH值、穩定性、有效期及適用性試驗等進行常規監控。標準菌株是微生物檢測過程中的標準物質。標準菌株性狀的典型與否直接影響檢驗結果的準確性。因此，標準菌株應從認可的國內外菌種保藏機構獲得或使用與標準菌株所有有關特性等效的可以溯源的商業派生菌株（后者僅可作為工作菌株），并于適宜的條件下保存。同時，在標準菌株的保藏過程中應定期對其進行純度分析，并確保生物學性狀和特性的典型。工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5代，以防止菌種發生變異風險。除了標準菌株外，環境中常見的污染菌株也可作為培養基適用性檢查的菌株，以利于目標性污染菌的檢出。生物安全是微生物檢驗實驗室應密切關注的問題。對于菌株（種）、陽性培養物應采取適當的措施（高壓滅菌）后再按普通廢棄物處理。同時，過期培養基也應考慮基于生物安全的處理措施。

應當指出的是上述影響因素均屬于內部質量控制范疇，而在內部質量控制的基礎上也應注意外部質量控制的重要性。外部質量控制也是藥品微生物檢驗實驗室質控的重要方面，能力驗證和實驗室間比對是檢驗檢測質量保證的重要組分，也是對實驗室檢驗檢測能力綜合判斷和內部質量控制效果檢驗的重要手段。能力驗證是對人員、儀器設備、環境設施、試劑耗材等的全面考核，有利于實驗室水平的提高和實驗室質量控制的不斷改進。

7 總結

藥品微生物控制是藥品質量控制的重要方面，微生物的檢測結果是進行風險評估與風險管理的重要依據，也是加強生產及檢驗過程控制的重要參考。該文從檢驗檢測方法、標準與方法、菌種、培養基、環境和儀器設備等方面對其可能影響微生物檢驗結果進行了綜合分析，對檢驗實驗室質量控制與提高提供了一定參考。但由于微生物檢驗的特殊性，影響藥品微生物檢驗結果準確性的因素還有很多。因此，要不斷探索影響檢驗結果的因素，加強實施實驗室的內部質量控制，持續改進，為微生物檢驗實驗室結果的可靠性和準確性提供依據，為提高藥品質量控制和監管提供支持。

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Analysis of Influence Factors of Laboratory Quality Control of Drug Microbiology Test

ZHANG Guo-lin1,2
1.Center for Drug Control and Testing,Suzhou,Jiangsu Province,215000 China;2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu Province,210000 China

The drug microbiology test is an important link of drug quality control and it is also the important way to ensure the public medication safety,and the microbiological test results are the important reference indexes of risk survey,risk evaluation and risk management and an important basis for improving the course control effect,and the paper elaborates the influence factors of drug microbiological test quality from the test standards,test and inspection method,strains and culture medium and environment control and instrument.

Microbiology test;Quality control;Influence factors;Risk evaluation;False positive or false negative

R95

A

1672-5654（2017）07（a）-0026-04

2017-04-09）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.19.026

蘇州市科技發展計劃 （應用基礎研究-醫療衛生）項目（SYSD201425）。

張國林（1983-），男，山東青州人，博士，副主任藥師，主要從事藥品質量控制方面的工作。