真菌源幾丁質酶在植物抗真菌病害中的應用

程笑笑, 馮自力, 馮鴻杰, 趙麗紅, 師勇強, 李志芳, 朱荷琴

(棉花生物學國家重點實驗室/中國農業科學院棉花研究所, 安陽 455000)

真菌源幾丁質酶在植物抗真菌病害中的應用

程笑笑, 馮自力, 馮鴻杰, 趙麗紅, 師勇強, 李志芳*, 朱荷琴*

(棉花生物學國家重點實驗室/中國農業科學院棉花研究所, 安陽 455000)

幾丁質酶可以降解大多數真菌細胞壁,阻止或中斷真菌在植物體內的侵染、定殖和擴展,在抗真菌病害的研究方面受到廣泛關注。本文綜述了真菌源幾丁質酶的特性,對真菌的抑制作用機制,轉幾丁質酶基因植株的抗性評價,產幾丁質酶菌株和相關制劑在生物防治方面的應用,并對其在生產上的發展前景進行了展望。

幾丁質酶基因; 植物真菌病害; 抗病轉基因

幾丁質在自然界中廣泛存在,又稱甲殼素,化學名稱為(1,4)-2-乙酰氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖,是由N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成的含氮多糖類生物性高分子[1]。作為天然高分子,幾丁質在地球上的蘊藏量僅次于纖維素,位居第二位。其主要來源于甲殼類動物的外殼、軟體動物的器官、藻類和真菌細胞壁等等。真菌細胞壁的3%～60%是由幾丁質構成的[2],幾丁質以微纖絲的形式錯落包埋于其基質中[3],可以被幾丁質酶催化水解生成N-乙酰葡糖胺。

幾丁質酶是幾丁質生物降解過程中的關鍵酶,廣泛存在于各種生物中,并參與其中的多種生理生化過程[4-5]。幾丁質酶水解幾丁質后產生的生物活性物質幾丁寡糖被廣泛應用在農、醫、化工、食品、環境保護等多個領域。真菌幾丁質酶作為幾丁質酶的重要成員,主要應用于生物防治植物病害或轉基因抗性育種。從廣泛的真菌資源中克隆出新的幾丁質酶基因,并研究其體外表達產物的酶學性質以及對真菌的抑制和抗病相關活性對于植物病害的生物防治和轉基因植物抗病的研究具有重要意義。

1 幾丁質酶及其特性

1905年,Benecke首次報道了微生物溶幾丁質芽胞桿菌Bacilluschitinourous能夠以幾丁質作為營養物質[6],Karrer和Hofinann在蝸牛胃液中發現能水解幾丁質的幾丁質酶[7],隨后人們逐漸關注并研究微生物幾丁質酶。

目前,發現能產幾丁質酶的微生物約有46個屬近70種,其中真菌有綠色木霉Trichodermaviride、哈茨木霉T.harzianum、淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus、枯草毛霉Mucorsubtilissimus、米曲霉Aspergillusoryzae、煙曲霉Aspergillusfumigatus、球孢白僵菌Beauveriabassiana、季也蒙假絲酵母Candidaguilliermondii、橄欖假絲酵母Candidaoleophila、疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyceslanuginosus等等,它們都是應用廣泛的重要生防菌[[8-12]。

根據在底物上作用位置不同可以把幾丁質酶分為內切幾丁質酶和外切幾丁質酶。其中內切幾丁質酶作用于同聚物內部β-1,4-糖苷鍵,隨機剪切內部的糖苷鍵,產生幾丁單糖和幾丁二糖等;外切幾丁質酶則作用于同聚物線性末端β-1,4-糖苷鍵,剪切幾丁質鏈的非還原末端,產生幾丁單糖。分析位于催化區的氨基酸序列,根據其氨基酸序列的同源性可以把幾丁質酶分為18、19和20家族。18家族的幾丁質酶大部分來源于細菌、真菌、病毒及少數植物。其中位于18家族β3和β4鏈上的兩段氨基酸序列是高度保守的,其催化區含有2個Asp和1個Glu,可能是活性位點的關鍵氨基酸。18家族幾丁質酶的水解產物為β異構體[13]。19家族的幾丁質酶大部分來源于植物和部分鏈霉菌屬真菌,水解產物是α異構體。18家族和19家族的幾丁質酶的氨基酸序列沒有同源性。20家族的幾丁質酶則基本上來源于鏈霉菌屬真菌與人類[14]。然而在最近幾年少數幾丁質酶也被鑒定為屬于23家族和48家族[15]。

雖然不同來源幾丁質酶之間的分子量差異比較大,但真菌源幾丁質酶大都具有相似的結構域。一般具有信號肽序列,幾丁質酶催化域,幾丁質結合域以及一個短的C端區域。催化域負責幾丁質的水解,是幾丁質酶主要功能區,且高度保守,兩個保守結構域分別為LISSGGW和DG-D-DWE[16],另外,在催化域還有6個Cys殘基參與了活性區的折疊。幾丁質結合區域主要負責與幾丁質結合,使催化域更好地發揮水解作用。真菌幾丁質酶的幾丁質結合區主要含有色氨酸殘基(W),與此不同的是,植物的該區域主要含有半胱氨酸殘基(C)[17]。目前還不太清楚幾丁質酶C端區域的作用。有報道20個氨基酸在Altermonassp. strain O-7的C端序列形成一個疏水核,酶蛋白通過細胞膜時這個疏水核起著重要作用[18]。真菌和酵母的幾丁質酶都還含有一個富含絲氨酸或蘇氨酸的區段,這個區段的作用可能也與酶的催化作用相關[19]。

阻遏物和誘導物能夠雙向調控真菌幾丁質酶基因的表達,一些易被利用的碳源如葡萄糖常起到阻遏的作用,而起誘導作用的一般為幾丁質或其降解產物。用純化的幾丁質或植物病原真菌(如立枯絲核菌Rhizoctoniasolani和灰葡萄孢Botrytiscinerea)細胞壁作唯一碳源,可在離體條件下誘導木霉產生幾丁質酶;相反,纖維素、脫乙酰殼多糖不僅不能誘導產生幾丁質酶,還會阻遏幾丁質酶合成。海洋酵母Rhodosporidiumpaludigenum在常規培養條件下幾丁質酶表達量少,但是經由幾丁質底物的誘導,該酶的表達量大幅增加,生防效果顯著提高[20]。有研究者推測幾丁質酶基因的誘導表達可能與物理性接觸細胞表面不溶性底物有關。幾丁質酶的誘導也受到RNA合成抑制劑8-羥基喹啉和蛋白質合成抑制劑放線菌酮的抑制,所以認為幾丁質酶的誘導是從頭合成的,要經過轉錄翻譯的過程[21]。綠僵菌幾丁二糖酶的表達不受代謝抑制物的影響,它伴隨幾丁質酶的表達而表達,幾丁二糖酶降解N-乙酰葡萄糖胺后的產物N-乙酰氨基葡萄糖可作為幾丁質酶的誘導物。這可以解釋在幾丁質酶活性低情況下為什么依然可以積累幾丁質還原糖,這種調節模式的特殊之處在于它是通過一種酶的表達實現對另一基因的調控。幾乎所有真菌產生幾丁質酶時都受到葡萄糖的抑制,真菌幾丁質酶基因的調控涉及分解代謝物阻遏機制,而阻遏物和誘導物系統能夠防止幾丁質酶的過量表達對微生物自身造成傷害[22]。

2 幾丁質酶抑菌作用機制

在病原真菌中,幾丁質是構成細胞壁的主要成分,其中子囊菌、擔子菌和半知菌的細胞壁以幾丁質和葡聚糖為主,接合菌的細胞壁則富含幾丁質和聚氨基葡萄糖。幾丁質酶作用于真菌的細胞壁后降解幾丁質釋放出還原糖,充分證明了幾丁質酶對真菌的抑制作用是發生在細胞壁上,通過破壞真菌細胞壁骨架,影響真菌形態建成、生長發育和致病力等[23]。

細胞壁是植物病原真菌進入寄主植物并與之直接接觸的先鋒結構[24],免疫化學技術直接證明了幾丁質酶與真菌細胞壁間的作用[25]。Mitchell發現所有能裂解真菌細胞壁的細菌菌株都含有幾丁質酶,這些細菌能在僅以幾丁質作為碳源的培養基上正常生長,而細胞壁中無幾丁質成分的真菌則不能被裂解[26]。幾丁質酶除了對真菌細胞壁有明顯降解作用外,還可以抑制孢子萌發、菌絲生長、芽管伸長等發育活動[27]。Toyoda等純化得到了來自灰霉素鏈霉菌Streptomycesgriseus的外源幾丁質酶,分別用其處理離體和活體的大麥胚芽鞘,發現正在發育的大麥白粉菌Erysiphegraminisf.sp.hordei吸器完全消解,已經發育成熟的病菌吸器的形狀雖未改變但菌絲的伸長和次生菌體的形成受到抑制[28]。Benhamou等觀察到木霉的幾丁質酶可有效裂解齊整小核菌Sclerotiumrolfsii菌絲體,不僅能夠通過水解菌絲頂端生長區域新合成的幾丁質破壞菌絲端部的生長,還可降解成熟的菌絲、分生孢子、厚垣孢子等含有幾丁質的組織,從而抑制其生長[29-30]。

細胞化學技術和電鏡技術的應用進一步闡明了幾丁質酶的抑菌機理。病原真菌細胞壁在幾丁質酶的作用下發生扭曲、變形，之后出現菌絲細胞壁腫脹裂解,細胞質聚集、原生質體外溢或裸露等異常現象,這些強烈的破壞作用使其不能正常生長[31]。因此,幾丁質酶具有抑制植物病原菌生長繁殖的功能,可有效從源頭減弱或阻止其對寄主的侵染。

3 幾丁質酶的生防應用

與植物相比,微生物具有生長周期短、便于生產、易于研究的特點,因此將真菌幾丁質酶應用于植物病原真菌的生物防治具備了良好的潛力。用對多種植物病原真菌有顯著抑制作用的鏈霉菌S01菌株外源表達的幾丁質酶處理病原菌,病原菌菌絲產生了扭曲變形,細胞質聚集、外溢的異常現象[32]。經過基因工程改造的重組幾丁質酶也具有良好的生防潛能,可有效抑制灰霉、根霉、毛霉和擬莖點霉的孢子萌發,當酶液濃度達到0.4%時,抑制率可達91%以上[33]。粉紅聚端孢Trichotheciumroseum經由SMCS誘導產生的胞外幾丁質酶對煙草赤星病菌Alternariaalternata、串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme、稻瘟病菌Magnaportheoryzae、棉花黃萎菌Verticilliumdahliae都有不同程度的抑制作用,其中對棉花黃萎菌的抑制作用最強[34]。鏈孢黏帚霉Gliocladiumcatenulatum分泌的幾丁質酶除對小麥雪腐病、葡萄白腐病、玉米黃斑病及斑點落葉病等的病原菌孢子萌發具有明顯的抑制作用外,還能明顯抑制核盤菌Sclerotiniasclerotiorum和立枯絲核菌Rhizoctoniasolani的菌核萌發,抑菌譜寬[35]。源自鏈孢黏帚霉HL-1-1菌株的幾丁質酶Gc CHI1可以明顯抑制立枯絲核菌、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea等多種植物病原真菌的菌絲生長、孢子萌發和菌核萌發[36]。利用不同幾丁質酶的協同作用,從理論上可獲得抑菌譜更廣泛、抑菌效果更加明顯的生防菌株。富集幾丁質酶的鏈霉菌和芽胞桿菌菌株混合發酵液對黃瓜枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum、產黃青霉Penicilliumchrysogenum、棉花枯萎病菌F.oxysporumf.sp.vasinfectum、小麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis、綠色木霉T.viride、黃瓜黑星病菌Cladosporiumcucumerinum和啤酒酵母Saccharomycescerevisiae起到不同程度的抑制作用,也具有一定廣譜性[37]。

幾丁質酶作為真菌細胞壁降解酶類的重要成員,是研究絲狀真菌和寄主植物相互作用的模式蛋白之一,具有良好的生防潛能,已成為該領域的研究熱點[38]。大部分產幾丁質酶的真菌可以直接或者間接抵御多種病原真菌對植物的侵染,體外表達的真菌源幾丁質酶對真菌的生長也有抑制作用,且都具有較為廣泛的抑菌譜,生防功效良好。

4 轉幾丁質酶基因植物與抗病性

幾丁質酶作為激發子可以直接啟動植物防御反應,也可以通過其降解真菌細胞壁產生的次生代謝產物(幾丁單糖和幾丁二糖等)誘導植物細胞做出系列防御反應,啟動植物系統獲得抗性反應,使植物體內病程相關蛋白(pathogenesis related protein)含量升高,提高抗病防御酶類活性,產生抗菌代謝產物(植保素和芳香族化合物等);堅固機械屏障,提高木質化程度,從而減少或阻止病原菌的成功侵染和擴散,提高植物抗病性[39-40]。

幾丁質酶作為直接由基因編碼的抗菌蛋白,其基因是利用遺傳工程技術進行抗病育種和提高生防菌對病原菌抑制作用的一個理想目標基因。轉外源幾丁質酶基因植物對某些病原的抗性增強。將植物源幾丁質酶基因轉化到水稻、甜菜、大豆、馬鈴薯等受體植物中,獲得的轉基因植物不僅對真菌病害具有一定的抗性, 而且還對植物線蟲、昆蟲和其他一些病原物具有抗性[41]。鑒于不同幾丁質酶作用位點的不同和催化區氨基酸排列多樣性，幾丁質酶對底物呈現出不同的偏好性[12-13],與植物源和細菌源的幾丁質酶相比,真菌幾丁質酶對真菌細胞壁中幾丁質的靶向性強,其轉基因植物對靶標真菌病害和非靶標病害均呈現出高效而廣譜的抗性,同時通過誘導系統獲得抗性而提高植物自身的抗病性,可以更好地應用于轉基因抗病育種[42]。將深綠木霉T.atroviride的ech42基因導入到煙草和馬鈴薯中,轉基因植株高抗立枯絲核菌R.solani、鏈格孢Alternariaspp.和灰葡萄孢B.cinerea,抗性優于細菌源或植物源幾丁質酶的轉基因株系[43]。菌寄生真菌粉紅聚端孢幾丁質酶基因trchi1作為優質抗性誘導基因被應用于多種植物,轉trchi1基因煙草對煙草赤星病和炭疽病抗性顯著提升,轉trchi1基因水稻植株對立枯絲核菌達到高抗級別[42-44]。與其他幾丁質酶相比,內切幾丁質酶具有更高的裂解活性和抗真菌活性[45],在主要通過合成內切幾丁質酶來提高植物抗病性的木霉中應用較為頻繁。轉哈茨木霉內切幾丁質酶基因的蘋果增強了對蘋果瘡痂病的抗性[46]。在轉木霉幾丁質酶ThEn-42基因煙草中,內切幾丁質酶基因的表達顯著提高了受體植物對多種病原真菌的抗性,轉ThEn-42基因水稻對紋枯病的抗性級別也明顯提高[45-47]。轉木霉幾丁質酶基因chit42的馬鈴薯中,內切幾丁質酶的表達顯著提高了受體植物對番茄早疫病和紋枯病的抗性[48]。轉木霉幾丁質酶基因的粳稻對水稻紋枯病和稻瘟病的抗性也得到了增強[49]。

除了將高活性的外源幾丁質酶基因轉入植物體以構建能表達高活力幾丁質酶的轉基因植物,也有通過改造菌體如導入高效啟動子以增加幾丁質酶基因的表達量。湯浩茹等構建了pBin19ESR載體,其含煙草花葉病毒35S雙啟動子和苜蓿花葉病毒引導序列控制下抗新霉素磷酸轉移酶基因(nptⅡ)和哈茨木霉幾丁質酶基因(ThEn-42),獲得的整合有ThEn-42基因的轉基因核桃的幾丁質酶活性比對照高幾十至幾千倍[50]。轉基因植株抗性的提高程度與其所表達的幾丁質酶活性也大都呈現正相關。轉內切幾丁質酶基因ech42的蘋果對蘋果黑星病的抗性與內切幾丁質酶活性呈顯著正相關[51]。轉ThEn-42的粳稻品種,其內切幾丁質酶活性水平相比非轉基因對照有大幅提高,也顯著增強了對稻瘟病和紋枯病的抵御能力[52]。編碼哈茨木霉內切幾丁質酶基因Chi18-12的轉錄豐度比Chi18-5的轉錄豐度高,但是整體幾丁質酶活性遠高于Chi18-12,這兩種內切幾丁質酶基因在秀麗隱桿線蟲卵寄生過程中以協同增效的方式發揮著重要作用[53]。

共轉化幾丁質酶基因、其他真菌細胞壁水解酶基因或者植物自身防衛基因,獲得具備更強、更穩定、更廣譜抗性的雙價或多價轉基因植株將會是未來的發展方向。Sharad等得到轉內切幾丁質酶基因ech42和內切葡聚糖酶基因bgn的番茄,與非轉基因對照相比,被番茄早疫病菌感染的葉面積極顯著降低,對齊整小核菌的防控效率高達83.4%,表現出了良好的抗性[54]。

理論上,似乎任何細胞壁含幾丁質的真菌都可被幾丁質酶部分降解,但是研究發現來源不同的幾丁質酶的抑菌作用具有選擇性:幾丁質酶只對一部分真菌具有明顯的抑制作用而對另一些真菌則沒有抑制作用。真菌細胞壁結構的差異、幾丁質所占比例的不同、幾丁質暴露程度的差異、真菌體內β-1,3-葡聚糖酶調節因子的作用、外源基因的類型、不同的植物種類、基因的表達水平或其他因子的作用都有可能影響幾丁質酶抑菌效果及選擇性,因此有必要對此再作深入研究,以擴大幾丁質酶抑菌譜[55]。

植物具有各種防御機制,以抵抗病原菌侵染。植物與病原菌互作的第一步為基于受體識別的微生物/病原相關分子模式(microbe/pathogen associated molecular patterns,MAMPs/PAMPs)激發的免疫反應,植物通過細胞表面受體(pattern recognition receptors,PRRs)識別病原菌的PAMPs而啟動植物的防衛反應[56-58]。幾丁質或可溶性幾丁質寡糖是潛在的MAMPs[59],幾丁寡糖被高度保守的模式識別受體(PRRs)和受體蛋白(RLPs)介導與植物受體結合。在水稻中第一個被報道響應幾丁質的免疫受體是幾丁質激發子結合蛋白(OsCEBiP)[60],隨后,OsCEBiP的同源二聚體——幾丁質激發子受體激酶(chitin elicitor receptor kinase)(OsCERK1)觸發Rac1鳥嘌呤核苷酸交換因子(OsRacGEF1)的磷酸化[61],通過小的 GTP酶Rac1激發MAPK級聯反應,啟動活性氧迸發,促進防御酶類的積累,誘導抗性相關蛋白的表達,從而使得植物產生系統獲得抗性[62]。

雖然目前對防御機制相關研究取得了一定進展,但是對胞外因子誘導免疫機制的理解仍不全面。如:病原真菌是如何感知和應答植物被誘導產生的免疫反應？如何行使真菌源激發子的功能,并與植物病程相關蛋白(pathogenesis-related protein)互作,營造互贏的共處模式？植物病原真菌如何高效合理使用幾丁質酶對抗異己、實現細胞壁再生,同時又保護細胞壁完整性[24]？這些還有待于進一步研究。

5 幾丁質酶制品

幾丁質酶作為對抗植物病原真菌的生物農藥,也可作為農藥增效劑與其他成分混配。如粘帚綠木霉幾丁質酶和葡聚糖苷酶組合使用,或與生物性抗真菌物和化學殺真菌劑混用有增效抗菌作用。

許多研究者致力于篩選表達高活性幾丁質酶的生防菌種,或應用生物技術以改良菌種。例如,使可產生幾丁質酶的木霉菌Trichodermasp.與土壤優勢植物病原菌的寄生菌T.hamatsuma融合,利用原生質體融合技術使后者具生產幾丁質酶能力[63]。陳振明等曾通過原生質體轉化的方法把來自綠色木霉的內切幾丁質酶基因的啟動子和mRNA的編碼區與來自構巢曲霉的色氨酸啟動子相連,然后導入球殼毛殼菌CG10來改造生防菌[64]。將纖維素基因cbhl1啟動子與深綠木霉幾丁質酶基因ThEn-42融合后轉入本身無幾丁質酶活性的里氏木霉RutC-30中,結果ThEn-42過度表達,轉化子產生的活性酶產量為基因供體菌產量的20倍(猜測可能是由于缺乏負調節機制),達130 mg/L,可作為幾丁質酶工業化生產用的菌種[65]。

由于幾丁質是真菌細胞壁的重要組成成分,而真菌生產條件相對簡單、周期短,因而成為生產幾丁質潛在的新來源和研究熱點。目前已從多種真菌如:釀酒酵母、白色扁絲霉、構巢曲霉、白僵菌、少孢根霉、哈茨木霉、玫煙色棒束孢等中分離出幾丁質酶[66-69],并優化了幾丁質酶提取工藝,獲得可以直接應用于生產的高產、高活性幾丁質酶制劑[70]。

也有研究者提出利用畢赤酵母表達系統來分析或表達真核蛋白,一方面能使某些蛋白糖基化更加穩定,另一方面也可將外源基因產生的蛋白質分泌到培養基中,便于產品的分離純化[71]。此外,幾丁質酶還可以有效用于制備真菌原生質體。真菌原生質體在研究酶的定位、超微結構以及細胞壁的再生等方面有著非常重要的作用[72];并且還可以用于臨床真菌早期感染檢測,目前已經提出了利用放射性標記幾丁質酶和幾丁質結合蛋白來作為真菌感染的早期檢測方法[73]。

基因重組的微生物具有生產方便、靶標菌不易產生抗性等優點,因此今后應篩選出產酶量高且適合工業化生產的基因工程菌及表達系統,研究最佳發酵工藝,探索使酶活穩定的方法,加工成適用劑型,從而推動我國幾丁質酶制劑的研究,使其更快、更好地為農業服務。

6 問題與展望

幾丁質酶研究已成為幾丁質科學中的一個重要分支,尤其是其酶解產物對環境友好安全,預示著良好的應用前景。目前,盡管有關真菌幾丁質酶及其在植物真菌病害防治中的作用報道較多,但由于幾丁質酶抑菌作用的選擇性,離生產上廣泛性應用的要求還有一定距離。此外,常溫真菌產生的幾丁質酶量少、穩定性差,在田間的應用受到限制。工程菌和轉基因植物的安全性一直是人們十分關注的問題,還需要對轉幾丁質酶基因工程菌和轉基因植物進行環境安全性評價。相信隨著發酵技術和基因工程技術的發展,真菌源幾丁質酶將在植物真菌病害生物防治中發揮更大的作用。

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(責任編輯：楊明麗)

Applications of fungal chitinase in the fungal disease-resistant plants

Cheng Xiaoxiao, Feng Zili, Feng Hongjie, Zhao Lihong, Shi Yongqiang, Li Zhifang, Zhu Heqin

(State Key Laboratory of Cotton Biology/Institute of Cotton Research of Chinese Academy ofAgricultural Sciences, Anyang 455000, China)

Chitinase, which can degrade most fungal cell walls, prevent or interrupt the fungal infection, colonization and expansion in plants, has attracted a lot attention in fungi disease resistance. In this paper, we reviewed the characteristics of chitinase originated from fungi, the inhibition mechanism to fungi,the resistance evaluation of the transgenic plants, the application of chitinase-producing strains and related products in the biological control, and prospects for the development in the future.

chitinase gene; plant fungal disease; resistant transgenic plant

2016-07-05

2016-08-29

公益性行業(農業)科研專項(201503109)

S 476.19

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.03.005

* 通信作者 E-mail：lizhifang2009@163.com；zhuheqin2012@163.com