植物病原真菌效應蛋白研究進展

摘要：真菌病原菌能分泌效應蛋白，影響真菌病原菌與植物的相互作用。本文概述了真菌病原菌的生活和侵染方式，以及效應蛋白的基因進化，指出真菌病原菌正是通過對基因組的區隔化完成效應蛋白基因的進化。重點討論活體營養型、死體營養型、半活體營養型和共生營養型效應蛋白的作用機制和植物適應性，以及效應蛋白的轉運、吸收和加工機制，可為研究真菌病原菌與作物的相互作用，并為未來作物抗病改良和病害防控策略的制定提供參考。

關鍵詞：植物感病；真菌；效應蛋白；基因進化；機制

中圖分類號： Q946.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0031-03

收稿日期：2015-09-06

基金項目：國家“863”計劃（編號：2012AA021701）；江蘇省自然科學基金青年基金（編號：BK2012073）；江蘇省生態學重點學科建設項目（編號：蘇教研[2012]2）。

作者簡介：周峰（1978—），男，山東淄博人，博士，副教授，從事植物生理生化研究。E-mail：zfibcas@163.com。[HJ]

[ZK）]

真菌病原菌通過各種方式侵染植物，侵染是由真菌病原菌分泌的成百上千種效應蛋白調控的。真菌效應蛋白可在真菌菌絲與宿主之間的相互作用區域直接轉移至植物體內而起作用。這些效應蛋白能抑制植物防御反應，調控植物生理機制使其能適應真菌侵染，并為真菌提供營養物質。植物病原真菌對農業經濟具有重大影響，因為它不僅危害作物生長，還能引起采后病害。據估算，世界上約有10%的農業減產與真菌病原菌的侵害有關[1]。目前，農民一般采取種植抗性品種或使用復合殺菌劑抵抗真菌侵染，但這些方法會對環境造成影響。本文概述了真菌效應蛋白引起的毒性及植物適應機制，重點討論真菌效應蛋白的作用機制、基因進化、轉運機制和加工方式等方面的研究進展，以期為病原真菌的生物防治和作物抗病改良提供參考。

1真菌病原菌的侵染

[JP2]真菌病原菌有不同的生活方式，包括死體營養型（necrotrophic）、活體營養型（biotrophic）和半活體營養型（hemibiotrophic）。所有侵染植物的真菌都能被植物免疫系統識別并引起宿主防御反應。這些防御反應的觸發是由保守的病原相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，簡稱PAMPs）、微生物相關分子模式（microbe-associated molecular patterns，簡稱MAMPs）激活。真菌中細胞壁的幾丁質是一種典型的PAMP，真菌侵染植物后，通過幾丁質酶將細胞壁中的幾丁質低聚糖釋放出來。PAMP通過模式識別受體（pattern-recognition receptors，簡稱PRRs）識別，這是植物第1道防御反應，即PAMP觸發免疫反應（PAMP-triggered immunity，簡稱PTI）。而病原菌為了抑制PTI 進化出效應蛋白，效應蛋白能被植物監測系統識別，觸發第2道防御反應，即效應蛋白觸發免疫反應（effector-triggered immunity，簡稱ETI）[2]。

侵染初期，真菌病原菌黏附于植物表皮，芽管開始生長，侵入的組織開始分化形成結構相似的附著胞（appressoria）或附著枝（hyphopodia）。真菌感受的信號是不同的，有氣孔、化學信號（如表面蠟質）、物理信號（如疏水性或向觸性）。不同生活方式的病原真菌會形成不同的附著胞，半活體營養型真菌如稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）、炭疽菌（Colletotrichum spp.）能形成圓頂形、黑化的附著胞，這樣可形成一定的膨壓使菌絲侵入宿主。大多數死體營養型真菌能形成不明顯的附著胞，通過分泌大量的細胞壁降解酶類（plant cell wall-degrading enzymes，簡稱PCWDEs）侵入植物角質層[3]。活體營養型病原菌在不影響宿主細胞生存的情況下，可通過膨壓和PCWDEs破壞細胞壁，而活體營養型有益菌則主要通過來源于宿主的細胞壁松弛酶作用而進入植物。

2真菌效應蛋白

真菌分泌蛋白能影響真菌與植物之間的相互作用，比如影響真菌生活方式和宿主特異性水平，它們一般占真菌蛋白質組的5%～10%。通常將效應蛋白定義為少于300個氨基酸的分泌蛋白質，它們往往富含半胱氨酸，其三級結構通過二硫鍵穩定，能幫助真菌病原菌侵染宿主并在宿主中定殖。近期研究表明，很多大分子蛋白質也可以作為效應蛋白，而且任何真菌分泌蛋白都可能是效應蛋白。大多數分泌效應蛋白的功能無法預測，PCWDEs效應蛋白可能是真菌滲透和孢子擴散所需要的，其余效應蛋白可能在植物靶目標的降解、修飾、抑制、活性改變和穩定性調控等方面起作用[4]。

死體營養型和半活體營養型的PCWDEs效應蛋白含量要高于活體營養型，與兼性腐生菌（saprotrophic）含量相似。這說明活體營養型真菌要適應植物，避免引起植物細胞損傷，導致細胞死亡。專一性的活營養體（obligate biotrophic）真菌的PCWDEs效應蛋白含量最低，反映它們在植物體外無法完成繁殖，必須通過根內叢枝從宿主處獲得碳水化合物。共生（symbiont）真菌的PCWDEs含量也明顯減少，它們也要適應嚴格的活體營養型生活方式，比如叢枝菌根（arbuscular mycorrhizas，簡稱AM）真菌Rhizophagus irregularis缺失所有的PCWDEs，它對植物的侵染和細胞內叢枝的發育可能依靠植物基因編碼的細胞壁修飾酶、膨脹素[5]。半活體營養型真菌的分泌蛋白含量最高，其分泌蛋白兼有死體營養型、活體營養型的共同特征。對半活體營養型真菌希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsianum）的全轉錄組學研究表明，編碼分泌蛋白的基因主要在最初的活體營養階段，而PCWDEs、裂解酶是在接下來的死體營養階段高表達。同樣，內生真菌Piriformospora indica也是在感染的最后階段才引起植物細胞死亡[6]。這些研究表明，PCWDEs與死體營養型有關，編碼未知功能的分泌蛋白表達是活體營養型的共同特征。

3效應蛋白的基因進化

植物與病原菌的相互作用中，植物通常具有抗性和不相容性作用，而病原菌往往具有兼容性或易感性，這種對立進化是基于基因對基因的相互作用模型。在這個模型中，宿主植物的抗性基因（resistance gene，簡稱R）產物若能發現病原菌無毒基因（avirulence gene，簡稱Avr）的效應產物，會導致不相容性，植物無病癥產生。相反，若因為等位基因的變異或缺少相關組件，則不能發現病原菌的Avr基因的效應產物，會出現相容性，真菌可在植株體內大量繁殖并產生癥狀[7]。這會形成1個盛衰（boom-bust）循環，在這個循環中，當宿主R基因缺少時，病原菌Avr基因會被選擇；當Avr基因普遍存在時，R基因會被選擇；當宿主R基因普遍存在時，能篩選到Avr基因；當Avr基因缺少時，能篩選到R基因。可見，boom-bust循環中R、Avr基因二者存在共進化的動態過程，這種動態共進化也存在于效應蛋白和植物靶基因對之間[8]。

效應蛋白的基因進化是在避免被宿主發現和最適毒性之間保持平衡，而病原菌的長期適應是依靠能不斷出現新的效應蛋白，替代原來已失去競爭力的效應蛋白或者能侵染新的宿主，這使得效應蛋白進化壓力增加并加速進化。研究發現，與編碼非分泌蛋白基因相比，編碼分泌蛋白的基因正選擇壓力明顯增大。此外，效應蛋白基因不僅可在種內基因水平轉移，還可在種間基因水平進行轉移。毒素蛋白ToxA的基因可從小麥葉斑病真菌（Stagonospora nodorum）轉移至小麥黃斑病真菌（Pyrenophora tritici-repentis），導致高毒力病原菌出現，引起世界范圍內的小麥葉片出現枯斑，最終影響到小麥的生長和產量[9]。這表明基因水平轉移有助于促進毒力的進化效應。植物病原菌面臨進化上的沖突，因為效應蛋白基因要求快速和靈活的進化，而大多數基因組則要求中等速度的進化，基因組通過對基因的區隔化解決這個矛盾。很多病原真菌具有稀疏基因的基因組區域，這些區域富含重復元件，推測為效應蛋白基因區域。真菌病原菌正是通過對基因組的區隔化完成效應蛋白基因的進化。

4效應蛋白作用機制

4.1活體營養型效應蛋白

關于活體營養型效應蛋白的研究廣泛。真菌侵染植物時，下調PAMPs引起的免疫反應。Pep1是玉米真菌病原體（Ustilago maydis）的分泌效應蛋白，與質外體積累黑穗病菌有關。POX12是1種玉米分泌過氧化物酶，是植物活性氧類（ROS）產生系統的保守組分。Pep1效應蛋白通過抑制POX12活性抑制植物防御系統，而[WTBX][STBX]pep1[WTBZ][STBZ]突變體則會引起強烈的植物防御反應。Pit2也是U. maydis的1種分泌效應蛋白，是病原菌產生毒力所必需的組分。Pit2通過抑制質外體玉米半胱氨酸蛋白酶活性從而抑制水楊酸相關植物防御反應[10]。

植物激素是引起植物防御反應的主要信號分子，水楊酸信號轉導途徑的激活主要用于抵御病原菌的侵害。U. maydis侵染植物時，會分泌大量的分支酸變位酶（chorismate mutase1，簡稱Cmu1）來消除水楊酸誘導的免疫反應。分支酸是水楊酸合成的前體物質，Cmu1的活性會降低分支酸的含量從而增強效應蛋白毒力。研究表明，效應蛋白還可影響植物的次生代謝途徑。U. maydis效應蛋白Tin2能促進花色素苷的生物合成，花色素苷的生物合成增加會減少其與木質素合成的共同前體物質香豆酸的生物含量，這會降低植物細胞壁的木質化程度，從而減弱植物對病原菌擴散的防御能力[11]。

4.2死體營養型效應蛋白

死體營養型效應蛋白可誘導植物細胞死亡，它們主要通過次生代謝產物如聚酮毒素、非核糖體多糖毒素、乙烯誘導多肽以及其他一些蛋白毒素起作用。死體型小麥病原菌S. nodorum、P. tritici-repentis可產生很多效應蛋白（如 SnTox1-Snn1、SnTox2-Snn2等）導致細胞壞死。這些效應蛋白與宿主敏感蛋白均是效應物觸發敏感性兼容相互作用所必需的，效應物觸發敏感性與ETI作用正好相反。例如，ToxA效應蛋白定位于葉綠體，能與ToxABP1蛋白相互作用，ToxABP1蛋白參與類囊體形成。這種相互作用導致光系統的破壞，引起細胞死亡[12]。近期研究表明，小RNA也起效應子的作用，通過重復元件產生的黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）小RNA與擬南芥ARGONAUTE 1蛋白結合從而對宿主RNA進行干涉，選擇性地沉默與這些RNA互補的宿主免疫基因[13]。

4.3半活體營養型效應蛋白

半活體營養型真菌結合了活體和死體營養型兩者的生活方式，例如它們需要效應蛋白去抑制植物防御反應，在后期殺死植物細胞。M. oryzae的類枯草桿菌蛋白酶（Slp1）在稻瘟菌感染早期階段會在植物和真菌接觸面積累，Slp1能結合幾丁質并抑制幾丁質觸發的PTI，[WTBX][STBX]Slp1[WTBZ][STBZ]基因敲除突變體對水稻的致病力受抑制，說明Slp1對稻瘟菌致病性起關鍵作用。[JP2]除了與植物抗性有關的質外體組分外，半活體營養型效應蛋白還可干擾胞質組分的植物免疫系統，稻瘟菌無毒基因AvrPiz-t的靶目標是水稻胞質R基因Piz-t。轉基因水稻中AvrPiz-t的表達可抑制PAMP觸發的ROS生成，增加對稻瘟菌的易感性，這表明效應蛋白AvrPiz-t通過抑制PTI促進稻瘟菌毒力[14]。希金斯炭疽菌（C. higginsianum）在侵染前、活體營養階段會誘導產生12個次生代謝基因簇，在這期間植物細胞還活著，說明這些次生代謝基因簇產物可能在操控宿主中起作用，其作用效果類似效應蛋白。C. higginsianum的誘導壞死蛋白ChNLP1能在轉換到死體營養型階段時特殊表達，并誘導本氏煙（Nicotiana benthamiana）植物細胞死亡，但這種細胞死亡可通過活體營養階段共表達ChEC效應蛋白而被抑制[15]。類似現象也存在于黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）中，說明誘導和抑制細胞死亡的效應蛋白之間的平衡能調控半活體營養型真菌從活體到死體營養型階段的轉換。

4.4共生營養型效應蛋白[HT]

叢枝菌根真菌（Glomus intraradices）的效應蛋白SP7能與宿主的乙烯響應轉錄因子ERF19相互作用，調控蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）防御相關基因表達，導致PTI的下調表達。當雙色蠟蘑（Laccaria bicolor）的MiSSP7效應蛋白感受到植物根的擴散信號時會高誘導表達，而且它是與植物根互惠共生所必需的。MiSSP7效應蛋白若缺失表達，雙色蠟蘑無法進入楊樹的根共生，這種缺陷可通過在轉基因植物的胞質中表達[WTBX][STBX]MiSSP7[WTBZ][STBZ]基因彌補。最近研究表明，定位于植物細胞核的MiSSP7效應蛋白能與PtJAZ6蛋白相互作用，而PtJAZ6蛋白是毛果楊（Populus trichocarpa）茉莉酸誘導基因表達的負調控因子。MiSSP7可阻止茉莉酸依賴的PtJAZ6蛋白的降解，進而抑制茉莉酸誘導基因的表達[16]。

5效應蛋白的轉運

真菌病原菌可通過內質網-高爾基體分泌系統將效應蛋白釋放到宿主細胞外。其中一些效應蛋白在細胞外起作用，被稱為胞外效應因子（如降解酶、毒素蛋白等）；另外一部分效應蛋白則可通過一些特殊途徑進入細胞內，被稱為胞內效應因子[7]。稻瘟菌Avr蛋白與其同源胞內宿主R蛋白共表達，可引起細胞死亡。這說明Avr蛋白在宿主細胞內也起作用。這是真菌效應蛋白可轉運至宿主細胞的第1個證據。但是關于宿主細胞吸收效應蛋白的分子機制尚缺乏系統研究。生物信息學手段無法鑒定出調控效應蛋白轉運的共有序列，缺少共有序列說明沒有普遍適用的效應蛋白轉運機制。不同的植物病原菌在植物定植過程中，可能與它們各式各樣的侵染結構一樣，其效應蛋白轉運方式也各不相同。但也有特例：白粉病真菌（powdery mildew）約80%的效應蛋白在信號肽下游具有N末端3肽共有序列（Y/F/WxC）；根內生真菌P. indica 的25個分泌效應蛋白都具有C末端RSIDELD模序，但是關于這些模序是否與效應蛋白轉運有關尚不清楚。刺亞麻柵銹菌（Melampsora lini）效應蛋白AvrM蛋白可通過不依賴病原菌的疏水通道，調控與植物細胞質膜的結合，效應蛋白是否能通過質膜的內吞作用進入宿主細胞尚須進一步研究[17-18]。

[JP2]由于缺少有效的真菌效應蛋白轉運測定方法，效應蛋白的轉運和吸收研究停滯不前。活細胞成像技術是一種研究植物細胞分泌和熒光蛋白（fluorescent protein，簡稱FP）標記效應物吸收的有效工具，但目前只在稻瘟菌效應蛋白轉運研究中有效。在這種半活體營養型真菌中，熒光標記的效應蛋白表現出2種定位方式，質外體效應蛋白分泌在菌絲周圍的基質中，而轉運效應蛋白存在于侵染菌絲上形成的活體營養表面復合體（biotrophic interfacial complex，簡稱BIC）以及植物細胞質、細胞核中。通過FP標記發現C. higginsianum侵染前，效應蛋白積累在其分泌部位胞孔處。侵染后，有2種定位方式：一些積累于凝集灶（discrete foci）中，這些凝集灶分散在真菌細胞壁與宿主植物細胞膜之間；其他則不間斷均勻分布在活體營養型真菌與植物接觸面上。C. orbiculare的FP標記效應蛋白存在于真菌細胞壁與植物細胞膜之間的活體菌絲頸部，形成環狀結構[19]。但FP標記效應蛋白無法進入宿主細胞細胞質，說明效應蛋白的轉運吸收機制可能需要去折疊蛋白。

6效應蛋白翻譯后加工

分泌蛋白進入內質網后，可在內質網發生N-糖基化、O-糖基化等翻譯后加工方式。研究發現，稻瘟菌[WTBX][STBX]ALG3[WTBZ][STBZ]基因編碼內質網定位的α-1，3甘露糖基轉移酶參與N-糖基化，這與稻瘟菌毒力有關。而在[WTBX][STBX]alg3[WTBZ][STBZ]突變體中，會產生大量ROS，這可能與Slp1未糖基化、幾丁質結合活性下降有關。N-糖基化也發生在U. maydis中，U. maydis的[WTBX][STBX]gas1[WTBZ][STBZ]突變體缺少葡萄糖苷酶Ⅱ，[WTBX][STBX]gls1[WTBZ][STBZ]突變體缺少葡萄糖苷酶Ⅰ，病原菌侵入后很快被宿主消滅并釋放大量ROS。一些效應蛋白，如番茄葉霉病菌（Cladosporium fulvum）的Avr4、Avr9效應蛋白，S. nodorum的SnToxA效應蛋白必須去除信號肽，進行N-末端加工后才有活性。此外，稻瘟菌編碼轉移金屬蛋白酶 Avr-Pita，必須經過N-末端加工才能引起過敏反應。S. nodorum的效應蛋白Rep1、Hum3、Rsp1需要通過枯草桿菌蛋白酶Kex2加工成重復蛋白，而在[WTBX][STBX]hum3/rsp1[WTBZ][STBZ]雙突變體中其毒力會受到明顯影響[8，20]。這說明效應蛋白要經過翻譯后加工才能將其轉變為活性形式，而在大腸桿菌中異源表達非糖基化效應蛋白，不僅沒有生物活性，侵染植物后也不穩定。

7展望

關于效應蛋白的毒力效應及轉運分子機制還處于起步研究階段，尤其是尚未鑒定出哪些效應蛋白能夠改變植物代謝以滿足侵染真菌的營養需要。調控效應蛋白基因表達的植物信號轉導途徑研究也非常缺乏。這些都是未來研究的重點領域，也有待于研究方法上的突破，以鑒定效應蛋白的具體功能及某些效應基因家族的功能冗余性和多樣性特點。此外，真菌效應蛋白除了作用于植物外，也可用于對抗其他微生物。這些對于研究真菌病原菌與作物的相互作用具有重要意義，并為未來作物抗病改良和病害防控策略提供理論依據。

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