蓖麻蠶核型多角體病毒的miRNAs生物信息學預測

錢荷英++李剛++何慶玲++羅旭芳++徐安英

摘要：首先在GenBank中下載蓖麻蠶核型多角體（PhcyNPV）全基因組序列，通過生物信息學的方法預測表明，PhcyNPV 基因組中有142條miRNA成熟體分子；再用miRanda、RNAhybird 2個軟件預測miRNAs對病毒自身的靶基因，提取有共同交集的33條miRNA。用PhcyNPV感染蓖麻蠶，取感病蓖麻蠶的脂肪體組織，提取總RNA；用逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR）驗證有共同交集的33條miRNA，確定其中6條為miRNA成熟體序列，分別是Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。這6條可能的miRNA對應的靶基因涉及病毒的融合蛋白、多角體蛋白等結構蛋白，以及一些蛋白激酶包括激活解旋酶表達的極早期基因等，推測其潛在的靶基因參與病毒復制及侵染的重要過程。

關鍵詞：蓖麻蠶；核型多角體病毒；miRNA；生物信息學

中圖分類號： S885.25文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）10-0053-09

收稿日期：2015-09-02

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-22）。

作者簡介：錢荷英（1971—），女，江蘇溧陽人，博士，副研究員，主要從事家蠶遺傳育種與分子生物學研究。E-mail：qianheying123@163.com。

通信作者：徐安英，研究員，主要從事家蠶遺傳育種與種質資源研究。E-mail：srixay@126.com。

[ZK）]

miRNA是一類大小約22 nt的單鏈小分子RNA，由具有發夾結構的長約70～90個堿基的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工得到，能夠和互補或部分互補的靶mRNA的3′末端非翻譯區（3′-UTR）結合，選擇性降解mRNA或抑制基因翻譯[1]。自miRNA被發現以來，迅速成為生命科學領域的研究熱點，因此開展miRNA的研究將對轉錄后基因調控領域的發展產生深遠影響。

病毒miRNA產生過程與其他生物類似，其成熟miRNA大小和結構也與其他生物的miRNA一致。病毒miRNA不僅可調節自身基因的表達，利于病毒復制及潛伏感染，還能調節宿主基因的表達并因此逃避宿主的免疫作用[2]。目前有關病毒miRNA的研究主要是關于哺乳動物的病毒，在昆蟲病毒方面鮮有研究，僅有棉鈴蟲夜蛾囊泡病毒（HvAV）和家蠶核型多角體病毒（BmNPV）有報道，前者編碼的miRNA可以抑制病毒DNA聚合酶的轉錄從而調控病毒自身的復制[3]，后者的miRNA功能尚未得到確鑿的試驗驗證[4-5]。

蓖麻蠶是我國的三大絹絲昆蟲之一，其核型多角體病毒病是生產中最常見的傳染病，具有發病快、傳染性強的特點，是制約蓖麻蠶產業發展的一大因素。蓖麻蠶核型多角體病毒（PhcyNPV）基因組已被解析[6]，但尚未見關于PhcyNPV的miRNA報道。本研究以期通過生物信息學方法對PhcyNPV編碼的miRNA進行預測，并進行試驗驗證，為探索PhcyNPV的感染機制及建立相關的診斷、治療方法提供一定的分子生物學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1蓖麻蠶及其核型多角體病毒蓖麻蠶品種B21、蓖麻蠶核型多角體病毒（PhcyNPV）均由中國農業科學院蠶業研究所保存。

1.1.2質粒與菌種T克隆質粒載體pMD18-T、大腸桿菌受體菌株購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3工具酶及相關試劑T4 DNA連接酶、蛋白酶K、高保真Taq酶、DNaseⅠ （RNase free）、DNA marker、PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ、質粒提取試劑盒，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；QIAEXⅡGel Extraction Kit，購自 TaKaRa 公司；TRIzol Reagent，購自Promege公司；其他化學試劑均為分析純，購自生工生物工程（上海）股份有限公司或國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4主要分析軟件及網站本研究所用分析軟件及網站如下：RNAhybird，http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html；miRanda，http：//www.microrna.org/；miR Base，http：//www.mirbase.org/；Mfold，http：//mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py？#forms：：mfold；Oligo 6.0、DNAMAN、DNAStar。

1.1.5引物設計與合成利用引物分析軟件Oligo 6.0設計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列見表1，此處反轉錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC******-3′，后6個堿基用“*”表示，根據成熟體序列設計，下游引物為5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。

1.2試驗方法

1.2.1預測PhcyNPV可能的編碼miRNA前體序列下載PhcyNPV全基因組序列（GenBank號：JX404026.1）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/427378890？report=fasta）導入vMir軟件，設定窗口大小為500 nt，遞進單位10 nt，最小發

夾結構長度50 nt，對PhcyNPV 全基因組中可能形成發夾結構的序列進行初步篩選。隨后，設定每條序列最低得分為115分，窗口最低為35，去除G+C含量不在30%～70%之間的序列以及那些位于蛋白編碼區的序列[7]，得到PhcyNPV 全基因組中可能編碼的miRNA前體序列。

1.2.2預測PhcyNPV可能編碼的成熟miRNA序列根據預測到的PhcyNPV miRNA前體序列的發夾結構，預測成熟的miRNA序列。成熟miRNA序列的長度平均為22 nt，位于前體發夾結構的3′端或者5′端臂上。還要參照的數據是成熟miRNA中A+U含量應在30%～70%以及發夾結構中miRNA與其互補的序列差異不能大于6 bp，推測每條miRNA前體序列上可能有的成熟體miRNA序列。

1.2.3預測成熟miRNA作用的病毒自身靶基因根據成熟體 miRNA序列5′端2～8位上的核苷酸與靶基因的mRNA序列的非編碼區（3′-UTR）互補的原理來預測靶基因[8]。為了提高預測的準確度，使用RNAhybird（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/welcome.html）和 miRanda（http：//www.microrna.org/）2個軟件分別進行靶基因預測，然后提取2個軟件預測的交集作為最終的預測結果，即可能的miRNA靶基因。

1.2.4成熟miRNA序列的逆轉錄PCR（reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR）驗證

1.2.4.1試驗組與對照組蓖麻蠶脂肪體總RNA的提取病毒接種及取材：取用正常蓖麻葉飼養的4齡蓖麻蠶（B21）起蠶100頭，分為試驗組、對照組，每組50頭。試驗組用移液槍取1.3×108個/mL多角體的PchyNPV病毒液，經口添飼蓖麻蠶，每頭喂8 μL，對照組喂8 μL蒸餾水。然后用蓖麻葉正常飼育，至試驗組蠶有發病癥狀（約飼養96 h）。收集對照組、試驗組蓖麻蠶的脂肪體組織，立即于-80 ℃保存、備用。

提取蓖麻蠶脂肪體組織總RNA，方法如下：（1）取冷凍的脂肪體組織，加液氮，充分研磨；（2）研缽中加入1 mL TRIzol，繼續研磨，至透明后轉移至離心管中；（3）室溫靜置5 min，加入200 μL三氯甲烷，倒置混勻15 s；（4）室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；（5）取上清，加入等體積的異丙醇（500 μL），倒置混勻；（6）室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；（7）棄上清，在沉淀中加入乙醇洗滌；（8）4 ℃、12 000 r/min 離心5 min后，輕輕倒掉乙醇，倒扣于超凈工作臺中控干乙醇；（9）加入40 μL DEPC水，溶解 10 min，測D260 nm/D280 nm，檢驗提取質量；（10）將溶解的樣品置于 -80 ℃ 保存、待用。

1.2.4.2反轉錄體系用試劑盒進行逆轉錄試驗，10 μL的逆轉錄體系：2 μL 5×PrimerScript buffer，0.5 μL PrimerScripTM RT Enyme Mix Ⅱ，0.5 μL OligdT引物，0.5 μL Random 6 mers，RNase free H2O 6 μL，0.5 μL模板；RT程序：56 ℃ 25 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。

PCR反應體系如下：13.2 μL ddH2O，2.5 μL Buffer，4.0 μL dNTP，1.5 μL引物F，1.5 μL引物R，2.0 μL cDNA溶液，0.3 μL Taq DNA聚合酶，總體積25 μL；PCR反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；72 ℃ 10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4.3回收PCR擴增產物將擴增的單一條帶且大小與目的條帶相符的PCR產物重新用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下切膠，稱質量，放入RNA專用的EP管中。加入3倍膠塊質量的Buffer B2，50 ℃水浴5～10 min，再加入1/3 Buffer B2體積的異丙醇；將融化的膠溶液移入吸附柱中，8 000 r/min 離心30 s，棄上清；沉淀中加入500 μL洗滌液，9 000 r/min 離心30 s，棄上清，重復洗1次；吸附柱于 9 000 r/min 離心1 min；將吸附柱置于干凈的1.5 mL離心管中，在吸附膜中加入30 μL無菌水溶解DNA，9 000 r/min 離心1 min，-20 ℃保存上清液。

1.2.4.4目的片段與PMD 18-T 載體的連接先將割膠回收的DNA重新進行PCR擴增，檢驗產物，將符合條件的DNA進行轉化。10 μL轉化體系：1 μL PMD 18-T 載體，4 μL回收的目的片段DNA，5 μL T4連接酶溶液，在連接儀中，于 16 ℃過夜。

1.2.4.5質粒DNA的轉化在DNA連接產物的全量混合液中加入100 μL感受態細胞（大腸桿菌E.coli DH10B），混勻至于冰上30 min（其間每隔15 min，手指彈勻1次），42 ℃ 熱激60 s，迅速置冰上2 min；再加入890 μL LB培養基（不含Amp），37 ℃振蕩1.0～1.5 h，12 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含Amp的液體培養基，涂布于LB平板培養基上，于37 ℃恒溫培養箱中過夜（約10～12 h）。

1.2.4.6重組質粒的鑒定及測序挑取多個白色單菌落轉化子于1.5 mL含有Amp的液體培養基中，37 ℃搖床培養過夜（12 h），然后于4 ℃保存。取菌液進行PCR驗證，20 μL PCR反應體系：13.2 μL ddH2O，2.0 μL buffer，0.4 μL dNTP，1.0 μL引物F，1.0 μL引物R，2.0 μL菌液，0.4 μL Taq E。PCR反應程序與“1.2.4.2”節的方法一致，PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將鑒定正確的菌液倒入EP管中，另加Amp與甘油，制成甘油菌，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.4.7預測的成熟miRNA序列與測序結果比對成熟體的序列一般為22 nt，位于前體序列的5′端或3′端，與其互補序列的差異不能多于6個堿基。將測序結果、成熟體序列與病毒基因組進行一一比對。

2結果與分析

2.1vMir 軟件預測PhcyNPV可能編碼的miRNA前體序列

將PhcyNPV全基因組序列（JX404026.1 ）導入分析軟件vMir，根據文獻介紹，預測參數如下：Window size，500 nt；Step size，10 nt；Min HP size，50 nt。

預測得到4 836個可能的小RNA前體序列，包括miRNA前體序列、長度、方向、分值信息，從而得到前體序列。

然后設置相應的參數，利用vMir軟件分析PhcyNPV基因組，產生所有PhcyNPV基因組中可能形成的發夾結構（圖1）。

[FK（W14][TPQHY1.tif][FK）]

2.2vMir viewer 查看和過濾 miRNA前體序列

通過文獻推薦的過濾參數（Score：115；Max HP size，100 nt；Window count，35），對4 836個miRNA前體進行過濾選擇，進一步篩選可能編碼的miRNA前體序列。將預測到的可能前體序列再與PhcyNPV 基因組中的ORF序列比對，如果這些預測序列位于蛋白編碼區，則應去除。由于病毒基因組中90%以上的序列都編碼蛋白，且ORF中幾乎不含內含子，因此絕大部分的預測序列將被去除。最終得到71個miRNA前體（表2），其分布展示如圖2所示。

2.3提取成熟的miRNA序列

成熟的miRNA分別位于前體的3′或者5′臂端，平均長度為22 nt。通過對71個前體miRNA序列進行分析，提取得到142個成熟的miRNA序列，詳見表3。

2.4預測結果與miRBase的同源性比對

將71條前體得到的142條成熟序列，與v20.0版本的miRBase（http：//www.mirbase.org/）數據庫的前體序列進行比對分析，發現共有134條成熟序列有同源性miRNA序列，其余8條則未見有同源序列，可能是PhcyNPV中特有的。

2.5PchyNPV可能編碼的成熟miRNA的靶基因預測

為了提高預測的準確度，使用2個軟件（miRanda、RNAhybird）分別預測miRNA成熟體的靶基因，然后提取這2個軟件預測的交集作為最終的預測結果。有33條miRNA成熟體序列預測到61個ORF（即病毒自身的靶基因）上，見表5。可以看出，成熟體miRNA可能調控的靶基因涉及PchyNPV基因組中各類基因，從時間上看有極早期基因（[WTBX][STBX]PE 38、pnk/pnl[WTBZ][STBZ]）、早期基因（[WTBX][STBX]ME53/hr2、P12、HE65）、滯早期基因（p31）、晚期表達基因（lef-3、lef-8、lef-9[WTBZ][STBZ]）；從功能上看，有與病毒復制相關基因、能影響病毒包埋相關基因、與經口感染相關因子、與宿主域相關基因、抑制宿主細胞凋亡基因、編碼合成與病毒復制及感染相關的酶與調節蛋白基因等，有的是核心基因，有的則是桿狀病毒的非必需基因。由此可見，在PchyNPV基因組中可能編碼的成熟體miRNA在蓖麻蠶核型多角體病毒侵染宿主蓖麻蠶的過程中，從侵染的起始到后期各個階段都可能通過調控病毒自身基因來實現病毒侵染寄主細胞的作用。

2.6預測的miRNA成熟體的RT-PCR驗證

根據“2.5”節中用miRanda、RNAhybird2個軟件分別預測成熟體miRNA的靶基因，有33條成熟體miRNA在2個軟件中都預測到相關的靶基因。選取這33條miRNA為研究對象，用RT-PCR驗證這些miRNA成熟體的序列。

根據成熟體序列設計相應的反轉錄引物以及PCR上游引物，將對照組和試驗組的蓖麻蠶脂肪體總RNA反轉錄成特異性的cDNA后進行PCR擴增，擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，有8條序列是單一條帶且序列的大小與理論預測值相符，部分電泳結果如圖3所示。

分別挑出這8條單一且大小接近64 bp的條帶，重新進行PCR驗證，依然呈現單一條帶，且大小符合理論值。由圖4可見，這8條帶對應的成熟體miRNA從1～8分別是Phcy-miR-177_3p、Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-696-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p、Phcy-miR-177_5p。

將這些PCR產物進行割膠回收、連接轉化，菌液PCR后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序產物與PhcyNPV基因組比對，有6條帶在基因組內有完全一致的序列，另外2條與基因組序列不一致。6條可能為PhcyNPV編碼的miRNA成熟體序列，分別為Phcy-miR-996_5p、Phcy-miR-5P、Phcy-miR-664_3p、Phcy-miR-30_5p、Phcy-miR-217_5p、Phcy-miR-1483_3p。PCR產物的電泳圖中顯示對照組的脂肪體cDNA也能擴增出大小相似的條帶（圖5），但是這些條帶經測序比對后發現與PchyNPV基因組不完全一致，因此認為不是目的條帶。

3結論與討論

本試驗利用計算機預測PhcyNPV中可能編碼的miRNA分子，共得到142條miRNAs序列。通過比對miRBase數據庫，發現134條有同源序列，其余8條則沒有同源序列，可能是PhcyNPV特有的miRNA分子。目前大多數研究都將重點放在miRNAs在宿主與病毒互作中的功能研究上，但越來越多的證據表明，miRNAs通過直接靶向病毒基因或改變自身基因的表達在防御反應中也起到重要作用。此外，由于本研究中預測的PhcyNPV的miRNAs數量較之前已研究的 BmNPV 的miRNA要多， 在試驗驗證miRNA成熟體序列之前，筆者先用miRanda、RNAhybird 2個軟件預測miRNA對病毒自身靶基因，然后選擇2個軟件均預測到相同靶基因的33條miRNA，再對這33條miRNA做試驗驗證，相對提高了驗證序列的可靠性。

從對BmNPV及其宿主家蠶的miRNA研究[4，9]看，miRNA的表達具有時間和空間的特異性，因此取什么組織作樣[CM（25]本和什么時間取樣就很重要。以往研究家蠶及

時，一般取病毒感染后的血液（或馬氏管）作為研究對象，因為這二者中病毒的復制數較高；考慮到病毒感染家蠶后，病毒和家蠶有個相互抗衡的過程，病毒需要有足夠的時間產生miRNA起作用，因此通常選擇感染后72 h取樣，希望獲得更多的miRNA分子序列。但是錢荷英等研究發現，在PhcyNPV感染蓖麻蠶后期的各組織中，脂肪體內的病毒基因拷貝數遠遠高于其他組織，且直到120 h還保持增殖趨勢[10]，這可能也間接提示PhcyNPV、BmNPV在感染各自寄主時有其相對特殊的感染方式。

在用RT-PCR進行PhcyNPV的miRNA成熟體序列驗證時，有的PCR產物出現并非專一的非目的條帶，可能是擴增了蓖麻蠶基因組產物所致，因為所取試驗材料中蓖麻蠶的組織樣品含量遠高于PhcyNPV，因此這些擴增條帶沒有割膠回收驗證。至于對照組織中也擴增出與目的片段大小相似且表達量相對較高的miRNA分子，可能是由于蓖麻蠶本身也會編碼產生相應的miRNA，而且這些miRNA 在病毒感染過程中也起到抑制、調控病毒的復制和侵染作用，因此導致對照組織中有miRNA分子被擴增出。鑒于目前沒有相對完整的蓖麻蠶基因組信息，因此對照組中擴增出的成熟miRNA分子無法驗證，只好忽略。

從靶基因預測結果看，1個miRNA可能作用于多個靶基因，而1個基因又可能受多條miRNA的調控，可見miRNA對病毒自身的調控是個復雜的網絡系統，涉及多種基因及病毒侵染的各個階段。由于完善的蓖麻蠶細胞系尚沒有建立，而PhcyNPV對已經成熟的幾個細胞系如Bm、sf等的感染性不理想，miRNA的生物學功能驗證試驗很難開展，這也是本研究的一大缺憾。

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