厭氧氨氧化功能微生物PCR—DGGE分析方法優化

畢瑋++李祥++劉恒蔚++黃勇++袁怡++劉忻

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.026

摘要：基于厭氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）開發的相關工藝在污水脫氮處理中具有重要作用；但Anammox微生物是一類目前尚不能分離和純培養的微生物，分析其功能微生物的類型，對于研究其生物學機理并改良其工藝具有重要意義。本研究對變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）在Anammox微生物應用中的分析條件進行了優化，以提高PCR-DGGE的分析效果。結果表明，采用針對16S rDNA V3區的 GC-F341/R518引物組合，PCR最佳退火溫度為64 ℃；DGGE電泳中，最佳上樣量為5～7 μL，最佳膠濃度為8%，最佳電壓/時間為80 V/16 h。優化后的PCR-DGGE具有準確性高和靈敏度好的特點。

關鍵詞：厭氧氨氧化；PCR-DGGE；微生物類型；條件優化

中圖分類號： S188文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0110-03

收稿日期：2015-09-30

基金項目：國家自然科學基金（編號：51478284）；國家自然科學基金青年科學基金（編號：51408387）。

作者簡介：畢瑋（1990—），男，碩士研究生，主要從事環境生物催化機理研究。E-mail：1012296010@qq.com。

通信作者：劉恒蔚，博士，副教授。E-mail：liuhw@mail.usts.edu.cn。厭氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）是指厭氧氨氧化細菌在厭氧條件下以羥胺和肼為中間產物，以NH+4 為電子供體、NO2-為電子受體，將NH+4 和NO-2 轉變為N2 的過程[1]。該反應顛覆了人們對自然界氮素循環的傳統認識。此前普遍認為通過異養反硝化即硝酸鹽還原生成N2，是地表氮素生成N2的唯一自然途徑，而目前卻發現Anammox反應的廣泛存在。據估計由AAOB完成了海洋生態系統氮轉化的30%～50%[2]。Anammox過程在地表氮素循環，包括農業水體氮素循環中起著重要作用?；贏nammox過程研究者開發了多種污水處理工藝[3-6]。與傳統的硝化-反硝化工藝相比，優點在于不需要額外電子供體，同時也可使剩余污泥產量降至最低，從而節省大量污泥處置費用。厭氧氨氧化細菌（即Anammox菌）是一類不可培養的微生物類型，難以使用傳統手段進行研究。目前共發現了包括Candidates Kuenen stuttgartiensis、Candidatus Brocadia anammoxidans、Candidatus Anammoxoglobus sulfate在內的5個屬12個種之多，而且不同的研究得到的優勢種群不同[7]。分析其功能微生物的類型，對于研究其生物學機理并改良其工藝具有重要意義。

PCR結合變性梯度凝膠電泳（deatring gradient gel electrophoresis，DGGE）技術不但克服了傳統的微生物培養方法的局限性，而且可以對微生物種群進行定性和定量，以及預測微生物種群的系統發育關系，成為研究環境微生物多樣性的常用手段之一。其主要原理是序列不同的DNA雙鏈解鏈所需的變性劑（尿素和甲酰胺）濃度也不同，在含梯度變性劑的凝膠電泳中，不同的DNA序列在不同的濃度處發生解鏈，導致空間構型改變，電泳速率急劇下降，從而停留在不同的位置，形成條帶分開的指紋圖譜。為了提高DGGE的分辨率，可在引物的一端加上1個含30～50個堿基的“GC夾板”（GC clamp）[8]。理論上，DGGE可以檢測出只有1個堿基差異的DNA序列。但是DGGE效果受多種因素影響，特別是對于不同的引物和不同的樣品，PCR-DGGE分析的參數差別很大。例如使用不同引物在對厭氧污泥樣本PCR-DGGE分析中[5-6，9-15]，聚丙烯酰胺凝膠濃度從5%～10%、電泳電壓從75～200 V均有使用。DGGE的分辨率直接影響結果的準確性和可靠性，而分辨率又會受到電泳中的變性劑梯度范圍、時間、電壓以及上樣量等因素影響；因此針對具體的樣品類型和引物，需對DGGE試驗各個關鍵參數進行優化，才能達到預期的效果。16S rDNA是細菌系統分類研究中最常用的分子指紋，分子大小適中，在結構與功能上具有高度的保守性?；?6S rDNA的V3區是微生物種群分析最常采用的目標序列之一，在分子生態研究中有廣泛的應用。

本研究基于Anammox微生物16S rDNA的V3區的 GC-F341/R518引物組合，對PCR的退火溫度和DGGE的時間/電壓、膠的濃度以及上樣量進行了優化，該結果對于 Anammox 反應相關微生物的分析具有參考意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗材料樣品來自蘇州科技學院環境生物技術研究所亞硝酸鹽型Anammox污泥。

1.1.2主要儀器與試劑DNA快速提取試劑盒購自MPBIO公司；NanoDrop2000儀；ExTaq酶購自TaKaRa公司；DGGE電泳儀（AD0412LS-C50）、DGGE電泳槽（DCode型）、凝膠成像系統（Gel DocTM XR+）購自美國伯樂公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1核酸提取與PCR-DGGE分析污泥取樣后立即使用液氮研磨成干粉，-80 ℃保存備用。使用DNA快速提取試劑盒提取DNA，提取的DNA經1%瓊脂糖電泳檢測和NanoDrop2000儀定量并檢測質量后使用。使用針對細菌16S rRNA基因V3可變區通用引物進行PCR，引物序列為：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTA

CGGGAGGCAGCAG（即GC-F341）；ATTACCGCGGCTGCTGG（即R518）。

PCR擴增體系總體積為30 μL，包括15 ng模板DNA，ExTaq酶1.5 U，10 μmol/L引物各1.5 μL，dNTPs Mixture（各2.5 mmol/L）3 μL，ExTaq酶buffer 3 μL，ddH2O補足至 30 μL。PCR擴增采用98 ℃預變性30 s；98 ℃變性10 s，根據設置的溫度退火30 s，72 ℃延伸5 s，共29個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物經2%瓊脂糖電泳檢測后，按不同上樣量均加入15 μL上樣緩沖液，并使用ddH2O補足至25 μL，利用DGGE電泳儀和DGGE電泳槽在變性梯度為45%～65%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳（100%的變性劑濃度為體積分數40% 甲酰胺和7 mol/L 尿素）。參考樂曉萍等的銀染方法[16]進行染色。銀染時凝膠在固定液（含體積分數10%乙醇和0.5%的乙酸）輕搖固定10 min，超純水漂洗1 min后放入染色液（含體積分數2%硝酸銀）中染色15 min，超純水快速沖洗2次后放入顯影液（含體積分數1.5%氫氧化鈉、體積分數02%甲醛）中至顯影清晰，用超純水沖去殘余的顯影液。銀染結果通過凝膠成像系統照相分析。

1.2.2PCR-DGGE優化（1）PCR退火溫度的優化：退火溫度從61～66 ℃之間設置6個梯度，梯度為1 ℃，PCR產物通過2.0%瓊脂糖電泳，選擇最合適的退火溫度用于PCR-DGGE分析以及后續優化過程。（2）電泳時間和電壓的優化：制備8%聚丙烯酰胺凝膠，設置60、80、100、120 V共4個電壓梯度；每隔2 h上樣1次，共上樣5次，即各設置5個時間梯度；上樣量為4.0 μL。在60 ℃條件下對不同電壓下分別進行不同時間進程的電泳試驗，以確定最佳的電壓/時間組合。（3）電泳上樣量的優化：配制總體積相同、但PCR擴增產物不同的上樣體系，上樣量（PCR擴增產物）為1～10 μL，梯度1 μL。使用最適變性劑梯度和已確定的最佳電壓/時間條件，在8%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳。（4）凝膠濃度優化：使用上述已確定的上樣量、最佳電泳時間和電壓組合，分別配制濃度為6%、8%和10%的聚丙烯酰胺凝膠，根據電泳效果來確定最適合的膠濃度。

2結果與分析

2.1土壤基因組DNA的提取

提取的Anammox樣品DNA經1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，結果（圖1）表明，DNA樣品質量較好，適合進行PCR-DGGE分析。

2.2PCR擴增的退火溫度優化

圖2是61～66 ℃不同退火溫度下的PCR電泳結果。圖2表明，退火溫度為64 ℃時，擴增效率高，效果最好，是本研究的最佳退火溫度。電泳結果顯示PCR產物大小與預計結果（230 bp）基本一致。

2.3電泳時間和電壓的優化

本試驗在預試中使用了200 V電壓進行DGGE電泳，結果發現，該電壓下條帶有彌散嚴重，分離效果較差，因此選擇在低電壓區進行優化。通過比較120 V（圖3-A）、100 V（圖3-B）、80 V（圖3-C）和60 V（圖3-D）的電泳結果說明，電壓高低對條帶的分離效果影響較為明顯，隨著電壓降低，彌散減弱，且條帶數增加，條帶更為清晰銳利。在80 V（圖3-C）和60 V（圖3-D）之間差異不大，均能得到數目較多且清晰銳利的條帶。隨著電泳時間延長，條帶分離更加明顯，易于區分，在80 V電壓時，多數條帶在16 h時分離效果最好，延長電泳時間變化不明顯，與60 V的電壓時18 h的電泳效果基本一致。鑒于此，選擇80 V/16 h作為最佳的電壓/時間組合。

2.4電泳上樣量的優化

從圖4可以看出上樣量對DGGE圖譜也有著重要的影響。上樣量過少，部分條帶不清晰，染色后可見的條帶數偏少；上樣量過多，則圖譜的背景過重，不利于后續的分析。考慮到二者的平衡，在Anammox微生物的PCR-DGGE分析中選擇5～7 μL的上樣量效果最好。

2.5凝膠濃度優化

本試驗通過3種不同濃度的凝膠[分別是6%（圖5-A）、8%（圖5-B）、10%（圖5-C）]來判斷最佳的凝膠濃度。從圖5的3個濃度對比可以看出，8%凝膠的分離度最好，條帶清晰銳利，為最佳凝膠濃度選擇。

3討論

DGGE技術被廣泛用于分析環境樣本微生物群落的生物多樣性，適合調查種群的時空變化，并可以通過對目的條帶進行序列分析來鑒定群落組成。理想的PCR引物和DGGE分析條件應適合探測更多的微生物類型。例如王寧等對厭氧顆粒污泥PCR-DGGE分析進行優化，發現古菌和細菌在80 V/10 h的電泳條件下均能得到分離效果較好的DGGE 圖譜[17]。而本研究結果說明對于Anammox活性污泥，采用GC-F341/R518通用引物，PCR最佳退火溫度為64 ℃；變性劑濃度為45%～65%的聚丙烯酰胺凝膠中進行DGGE電泳的最佳上樣量為5～7 μL，膠濃度為8%，最佳電壓/時間為80 V/16 h。由于本研究采用針對16S rDNA的V3區的特異引物，對于環境樣本的不同微生物種類將具有更廣泛的適用性。

PCR和電泳是PCR-DGGE分析的2個最關鍵環節，本試驗研究表明適當提高退火溫度有利于減少非特異性擴增，上樣量的多少與膠濃度的大小也對DGGE的分辨率有重要影響。此外，與一般的PCR對模板DNA要求低不同，本研究中還發現DNA質量對PCR影響較大，且PCR擴增質量顯著影響DGGE的分辨率。

參考文獻：

[1]Strous M，Fuerst J A，Kramer E H，et al. Missing lithotroph identified as new planctomycete[J]. Nature，1999，400（6743）：446-449.

[2]Dalsgaard T，Canfield DE，Petersen J，et al. N2 production by the anammox reaction in the anoxic water column of Golfo Dulce，Costa Rica[J]. Nature，2003，422（6932）：606-608.

[3]Van Dongen U，Jetten M S，van Loosdrecht M C. The SHARON-Anammox process for treatment of ammonium rich wastewater[J]. Water Science and Technology，2001，44（1）：153-160.

[4]Despland L M，Clark M W，Vancov T，et al. Nutrient removal and microbial communities development in a young unplanted constructed wetland using BauxsolTM pellets to treat wastewater[J]. Science of the Total Environment，2014，484：167-175.

[5]Liang Y，Li D，Zhang X，et al. Stability and nitrite-oxidizing bacteria community structure in different high-rate CANON reactors[J]. Bioresource Technology，2015，175：189-194.

[6]Zhong Y M，Jia X S. Simultaneous ANAMMOX and denitrification （SAD） process in batch tests[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2013，29（1）：51-61.

[7]Ding S，Zheng P，Lu H，et al. Ecological characteristics of anaerobic ammonia oxidizing bacteria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（5）：1841-1849.

[8]Strathdee F，Free A. Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）：methods and protocols[M]//Makovet S.DNA Electrophoresis. New York：Humana Press，2013：145-157.

[9]Vipindas P V，Anas A，Jasmin C，et al. Bacterial domination over Archaea in ammonia oxidation in a monsoon-driven tropical estuary[J]. Microb Ecol，2015，69（3）：544-553.

[10]Kawagoshi Y，Fujisaki K，Tomoshige Y，et al. Temperature effect on nitrogen removal performance and bacterial community in culture of marine anammox bacteria derived from sea-based waste disposal site[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113（4）：515-520.

[11]Sonthiphand P，Neufeld J D. Evaluating primers for profiling anaerobic ammonia oxidizing bacteria within freshwater environments[J]. PLoS One，2013，8（3）：e57242.

[12]Zekker I，Rikmann E，Tenno T，et al. Anammox enrichment from reject water on blank biofilm carriers and carriers containing nitrifying biomass：operation of two moving bed biofilm reactors （MBBR）[J]. Biodegradation，2012，23（4）：547-560.

[13]Xiao Y，Zeng G M，Yang Z H，et al. Coexistence of nitrifiers，denitrifiers and Anammox bacteria in a sequencing batch biofilm reactor as revealed by PCR‐DGGE[J]. Journal of Applied Microbiology，2009，106（2）：496-505.

[14]Gabarró J，Ganigué R，Gich F，et al. Effect of temperature on AOB activity of a partial nitritation SBR treating landfill leachate with extremely high nitrogen concentration[J]. Bioresource Technology，2012，126：283-289.

[15]于潔. 可降解纖維素的微生物菌群篩選及其性質初探[D]. 天津：天津理工大學，2010.

[16]樂曉萍，杜鵬，張欽憲，等. 聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良[J]. 河南醫科大學學報，2001，36（4）：395-396.

[17]王寧，劉永紅，李佳鳳，等. 厭氧顆粒污泥PCR-DGGE圖譜的優化研究[J]. 中國沼氣，2014（3）：8-13.李靜婷，趙旭耀，劉超凡，等. 熱脅迫對轉TasHSP16.9擬南芥幼苗生長生理特性的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44（10）：113-116.