鎘暴露對蛋雞卵巢的毒性損傷及酵母硒的保護效應

王倩倩++陳大偉

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.077

摘要：將90羽40周齡海蘭褐蛋雞隨機分為3組，每組30羽，每組設3個重復，每個重復10羽。采用飲水染毒方式對蛋雞進行Cd暴露（50 mg/L）和酵母硒保護試驗（飼料中添加3%酵母硒），試驗周期為8周。結果表明：與對照組比較，Cd組血清E2、P4含量呈類似變化，分別自第2、4周顯著下降（P<0.05）；卵巢組織中SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），MDA含量極顯著升高（P<0.01）；Cd組SOD活性下降了3245%（P<0.01），GSH-Px活性下降了26.26%（P<0.01），GSH含量下降了19.83%（P<0.01），MDA含量升高了37.03%（P<0.01）；卵巢Cd含量極顯著升高。超微結構觀察發現Cd組卵巢顆粒細胞染色質邊集、線粒體嵴斷裂、空泡化、微絨毛斷裂等損傷變化。與Cd組相比，Se保護組血清E2、P4含量自第6周顯著升高，卵巢SOD活性、GSH含量均顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。卵巢硒含量極顯著升高，Cd含量差異不顯著，卵巢微絨毛、線粒體、細胞核等損傷變化輕于Cd組。綜上所述，Cd引起的氧化應激是Cd致蛋雞卵巢損傷的重要原因，氧化應激引起的卵巢顆粒細胞凋亡可能是造成蛋雞血清雌激素水平下降的原因之一。酵母硒通過緩解卵巢組織脂質過氧化損傷，減輕Cd對卵巢細胞微絨毛及線粒體的損傷，對蛋雞Cd暴露引起的卵巢損傷具有一定緩解作用。

關鍵詞：蛋雞；鎘暴露；酵母硒；卵巢；保護效應

中圖分類號： S858.31文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0278-03

收稿日期：2015-12-09

基金項目：江蘇省家禽科學研究所博士基金（編號：JQ201201）；江蘇省自然科學基金（編號：BK20131235）。

作者簡介：王倩倩（1984—），女，江蘇南通人，獸醫師，主要從事畜禽疾病防控。E-mail：158373585@qq.com。

通信作者：陳大偉，助理研究員。E-mail：ydcdw83@sina.com。鎘（cadmium，Cd）是一種毒性很強的有色重金屬元素，少量Cd持續進入體內便可能引發嚴重的中毒癥狀，各種動物均能發生Cd中毒。有關Cd對肝臟、腎臟、睪丸等器官的毒性研究報道[1-4]較多，但Cd對雌性家禽生殖毒性的研究報道相對較少。Cd作為一種高度可疑的環境內分泌干擾物，已引起人們的廣泛關注。體外試驗表明，Cd可降低大鼠血清中孕酮、雌二醇水平，抑制類固醇合成，可能直接影響顆粒細胞和黃體細胞的功能[5-6]。

硒是動物必需的一種微量營養物質，在體內發揮著多種生物學效應，作為硒蛋白、含硒酶的必要成分在機體內發揮抗氧化作用，抑制脂質過氧化，消除過多自由基，從而保護生物體的膜結構與功能。近年來研究發現，硒還具有抗應激、提高免疫力、促生長、改善肉質、提高動物繁殖能力等重要作用[7-8]。目前應用于畜禽生產的硒主要為亞硒酸鈉等無機硒，而無機硒的使用會帶來諸多弊端。與無機硒相比，來源于植物或富硒酵母的有機硒具有很多優勢，在飼料中添加應用毒性較小，具有抗氧化特性及較高的組織沉積率、生物利用率，從而減少對環境的污染[9]，因此提倡在飼料中添加應用有機硒源的硒。而關于有機硒源對蛋雞Cd暴露后卵巢保護效應的研究尚未見報道。

本研究通過飲水染毒進行Cd暴露，同時在飼料中添加酵母硒，探討有機硒對Cd暴露蛋雞體內激素、卵巢脂質過氧化水平及超微結構、Cd蓄積的影響，旨在觀察Cd對產蛋雞的生殖毒性特點，并為以有機硒為主的環保型Cd拮抗劑在蛋雞生產中的應用提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

氯化鎘（CdCl2）購自國藥集團，分析純，含量大于99%；酵母硒（拉曼硒）。試驗于農業部家禽品質監督檢驗測試中心（揚州）生產性能測定站進行，試驗動物為商品海蘭褐殼蛋雞。

1.2試驗設計

將90羽體質量生產性能基本一致的40周齡海蘭褐殼蛋雞隨機分為3組，每組3個重復，每個重復10羽雞。Cd組在飲水中添加Cd 50 mg/L；硒保護組在飲水中添加Cd 50 mg/L，同時在飼料中添加3%的酵母硒（Cd添加質量濃度參考GB 5749—2006《飲用水水質標準》，Cd≤0.05 mg/L，在此限量標準的基礎上提高1 000倍）；對照組飲用純凈水。根據NY/T 33—2004《雞飼養標準》中蛋雞的營養需要配制常規玉米-豆粕型飼糧，作為試驗基礎飼糧。經測定，該飼糧中Cd含量為（0.065±0.003） mg/kg，酵母硒中硒含量為（2 004±1.24） mg/kg。采用3層全階梯籠養，自由采食和飲水，預試驗期為1周，正式試驗期為8周。

1.3指標及測定方法

1.3.1性腺激素含量的測定分別于試驗第2、4、6、8周末進行翅靜脈采血，分離血清，采用化學發光法測定血清中E2、P4含量。化學發光測定試劑盒購自深圳新產業生物醫學工程有限公司。

1.3.2卵巢抗氧化指標的測定染毒結束后，將蛋雞頸動脈放血處死；摘取雙側卵巢，去除蛋黃，準確稱取0.2 g卵巢組織，加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，于冰浴條件下采用高速電動勻漿機制備10%組織勻漿；將勻漿液以3 000 r/min離心20 min后取上清。主要測定超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、還原型谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，試劑配制和試驗操作均按說明書進行。

1.3.3卵巢超微結構觀察迅速采集剛處死蛋雞的卵巢組織，將其切為約1 mm3的小塊，采用新鮮配制的25 g/L戊二醛溶液固定后，常規制備超薄切片。采用JEM-100CXⅡ型透射電鏡（Philips公司）觀察并拍照。

1.3.4卵巢中Cd、硒含量的測定試驗結束后，以頸動脈放血處死雞并采集卵巢。采用微波消解法處理制備樣品，采用ICP-MS（XseriesⅡ，美國Thermo scientific）法測定樣品中的硒、Cd含量。

1.4數據處理

試驗數據均以“平均值±標準誤”表示。采用SPSS 17.0軟件對試驗數據進行單因子方差分析，采用LSD及Duncans多重比較對各處理間的平均值進行差異顯著性檢驗。

2結果與分析

2.1血清中性腺激素含量

由表1可知，與對照組相比，Cd組E2含量自第4周顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），保護組自第6周顯著降低（P<0.05）。與對照組相比，Cd組E2含量分別降低了6.28%、12.48%、15.30%、17.69%，硒保護組分別降低了505%、9.70%、10.59%、12.91%。血清中P4含量的變化與E2相似，與對照組相比，Cd組自第4周顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），保護組自第6周顯著降低（P<005）。與對照組相比，Cd組P4含量分別降低了8.82%、1336%、20.94%、20.71%，硒保護組分別降低了7.14%、769%、12.82%、13.63%。添加酵母硒一定程度上恢復了Cd引起的血清E2和P4水平的下降。

2.2卵巢組織抗氧化指標

由表2可知，與對照組相比，染Cd組和酵母硒保護組的SOD活性、GSH-Px活性、GSH含量均顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01），MDA含量顯著或極顯著升高（P<005或P<0.01）；與染Cd組相比，酵母硒保護組的SOD活性、GSH含量均顯著升高（P<0.05），MDA含量顯著降低（P<0.05）。其中，Cd組和保護組的SOD活性分別低于對照組32.45%、16.81%，GSH-Px活性分別低于對照組2626%、16.07%，GSH含量分別低于對照組19.83%、851%，MDA含量分別高于對照組37.03%、17.07%。可見，Cd染毒使卵巢發生脂質過氧化反應，酵母硒通過增強抗氧化酶活性、減少脂質過氧化物的產生緩解Cd對蛋雞卵巢的氧化損傷。

2.3卵巢超微結構變化

超微結構觀察發現，對照組卵巢細胞結構完整，線粒體結構清晰完整，卵母細胞微絨毛排列緊密、結構完整（圖1-A、圖1-D）。Cd組部分卵母細胞微絨毛散亂、稀疏、斷裂，顆粒細胞染色質邊集，線粒體膜不完整，部分嵴斷裂空泡化（圖1-B、圖1-E）。硒保護組線粒體結構基本完整，微絨毛排列略顯稀疏，但排列整齊，且較少斷裂（圖1-C、圖1-F）。可見，硒保護組的損傷程度低于Cd染毒組（圖1中“↑”所示）。

2.4卵巢中Cd和硒含量

由表3可知，與對照組相比，Cd組卵巢中Cd含量極顯著升高，硒含量無顯著差異；硒保護組硒含量極顯著升高。與Cd組相比，硒保護組Cd含量略有升高，但差異不顯著，硒含量極顯著升高。添加酵母硒提高了卵巢中硒含量，可能促進含硒抗氧化酶活性的提高，但不能減輕Cd在卵巢中的沉積。

3結論與討論

近年來，Cd的生殖內分泌干擾作用引起了人們的廣泛關注。其中，Cd對孕激素合成的影響已成為研究熱點之一。Cd可降低血清中E2和P4濃度。Paksy等在體外培養顆粒細胞和黃體細胞，向培養液中加入不同濃度的CdCl2溶液，觀察CdCl2對E2和P4的影響；結果表明，體外給予CdCl2可抑制顆粒細胞和黃體細胞合成E2和P4[5]。在體試驗也表明，Cd可降低大鼠血清內E2和P4濃度，并存在劑量效應[10-11]。本試驗結果表明，Cd組血清中E2、P4濃度均降低，且隨著染Cd時間的延長呈明顯時間效應，這與以往報道基本一致。

氧化應激是介導Cd毒性損傷作用的主要原因之一[12-14]。本研究發現，蛋雞Cd暴露后卵巢組織的MDA含量增加，抗氧化酶SOD活性、GSH-Px活性均降低，抗氧化物GSH含量下降，表明Cd引起的蛋雞卵巢損傷同樣與脂質過氧化密切相關。添加酵母硒對Cd引起的卵巢氧化損傷具有一定改善作用，這與在大鼠肝臟中的研究結果一致，硒通過降低MDA水平、增加抗氧化酶活性來拮抗Cd的毒性損傷[15]。硒保護組卵巢中硒含量增加，Cd含量與Cd暴露組相當，表明同時飼喂酵母不能減少Cd在卵巢中的蓄積；而硒保護組GSH-Px活性的升高與補硒直接相關，表明補硒能通過增強組織中GSH-Px活性清除自由基來拮抗Cd的毒性損傷。

進一步通過超微結構觀察發現，卵泡顆粒細胞出現以凋亡為主的形態變化。筆者推斷，血清中E2、P4含量變化可能的原因為Cd損傷卵巢組織，抑制卵泡發育，使卵泡閉鎖增加，卵泡內膜細胞、卵泡顆粒細胞的形態結構均受到損傷。Cd可在卵巢組織中蓄積，可能通過與雌激素受體、孕酮受體等類固醇激素受體結合介導發揮其毒性作用，使血清中E2、P4水平降低[16]。

超微結構研究顯示，卵巢組織結構受損，其中微絨毛的變化最為明顯。卵泡中各微細結構的生理功能及其變化與卵泡發育存在密切關系。微絨毛是細胞表面的特定結構，是細胞膜和細胞質向細胞表面伸出的指狀凸起，能夠使細胞的表面積增加幾十倍。卵母細胞通過微絨毛結構與卵泡顆粒細胞發生聯系，從而進行物質交換和信息傳遞，獲得養分和信息因子。在發育階段，卵母細胞代謝旺盛，微絨毛較多，以便更多吸收顆粒細胞輸送來的營養物質；同時，對來自顆粒細胞的各種信息因子也最為敏感。如果卵泡細胞激素分泌發生變動或營養供應受阻，卵泡顆粒細胞先行退化，隨之微絨毛退化，從而引起卵母細胞閉鎖[17]。Cd組微絨毛散亂、稀疏，部分斷裂，卵泡顆粒細胞形態結構均受到損傷，直接影響E2、P2的分泌；結合線粒體的結構變化，進一步證明氧化應激是Cd暴露引起卵母細胞損傷的主要原因。

添加酵母硒可緩解Cd暴露引起的產蛋率下降，有效降低Cd暴露引起的卵巢組織脂質過氧化損傷，同時提升血清中E2、P4的含量水平，有效改善Cd暴露引起的卵巢細胞微絨毛、線粒體等超微結構的損傷。可見，酵母硒可通過減緩Cd暴露所致的脂質過氧化反應來拮抗Cd對蛋雞卵巢的毒性損傷，飼料中添加酵母硒對Cd所致蛋雞卵巢毒性損傷具有一定的保護效果。

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