1株高產IAA菌株的篩選、鑒定及對白菜的促生作用

邢芳芳++高明夫++胡兆平++李新柱

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.132

摘要：從番茄根際采集的土壤中分離篩選得到12株產IAA的菌株，經復篩獲得1株具有較好IAA生產能力的細菌，其發酵24 h產IAA水平達到48 mg/L以上，將其命名為HB-1。通過對菌株HB-1的16S rDNA序列分析對該菌進行鑒定，并將菌株HB-1進行液體發酵擴繁，將得到的發酵液沖施白菜，試驗其促生作用。結果表明，該高產IAA菌株為枯草芽孢桿菌。盆栽試驗結果表明，菌株HB-1對白菜生長具有明顯的促生作用，施加HB-1發酵液處理的葉綠素含量、葉片數均高于對照（CK）；HB-1發酵液處理的鮮質量、干質量與沖施清水的CK相比都增加，鮮質量增加 1.54～17.98 g，增幅達1.16%～13.55%，差異達到顯著水平，干質量增加0.26～1.32 g，增幅達到2.97%～1492%。其中添加發酵液1.0 mL/盆的處理組效果較好，葉綠素含量比CK高5.02%，葉片數比CK高15.78%，鮮質量較空白處理增加 17.98 g，增幅達13.55%，差異達極顯著水平，干質量平均增加1.32 g，增幅達到14.92%。

關鍵詞：IAA；篩選；鑒定；枯草芽孢桿菌；促生作用

中圖分類號：S144文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）09-0458-03

收稿日期：2015-09-14

基金項目：山東省科技重大專項（新興產業）（編號：2015ZDXX0502B02）。

作者簡介：邢芳芳（1982—），女，山東臨沂人，碩士研究生，工程師，主要從事新型肥料研發及其施肥研究。Tel：（0539）7198803；E-mail：xingfangfang@kingenta.com。

通信作者：李新柱，博士研究生，工程師，主要從事新型肥料研發及其施肥研究。Tel：（0539）7198803；E-mail：lixinzhu@kingenta.com。植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，簡稱PGPR）是指能夠通過分泌有益物質直接或間接促進植物生長的細菌[1]。產生植物激素是根際促生細菌與植物相互作用的主要機制之一。吲哚乙酸（indole 3 aceticacid，簡稱IAA）是產生調節植物生長素的信號物質，是在植物體內普遍存在的生長素物質[2]。自1977年科學家發現巴西固氮螺菌能合成IAA后，更多研究發現，土壤中約50%以上的細菌可以產生IAA[3]。篩選具有產生IAA的微生物可為促生生物肥料的研發等提供出發菌株。

本研究對番茄根際產IAA菌株進行分離、鑒定及盆栽促生效果研究，以期為開發高效根際促生菌劑、生物肥料資源提供生物學支撐。

1材料與方法

1.1土壤樣品

在山東省壽光市采集同一區域內生長情況良好的番茄根際范圍的土壤。采樣過程中，首先剝離土壤表面覆蓋的凋落物，然后剔除石塊等雜物，最后使用滅菌采樣鏟采集10～20 cm 深的土壤樣品裝于滅菌袋中，帶回實驗室后置于4 ℃冰箱保存，及時分離。

1.2培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0 g NaCl，20.0 g瓊脂，加蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH值為7.0～7.2，10 000 Pa滅菌30 min。

LB液體培養基[4]：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g NaCl，pH值7.4，滅菌后用細菌過濾器加入L-色氨酸至濃度100 mg/L。

1.3儀器和試劑

主要儀器：Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國Therom Fisher）、紫外檢測器VWD-3100（美國Therom Fisher）、恒溫振蕩搖床ZHTY-70（上海知楚儀器有限公司）、電熱恒溫培養箱BPX-272（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）。

主要試劑：Salkowski顯色液[5]，50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3；IAA標準品；Sigma公司提供的HPLC試劑。

1.4菌株的分離

稱取土壤樣品10 g，加入帶玻璃珠并裝有100 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，振蕩20 min，靜置10 min形成濃度為 0.1 g/mL 菌懸液，對此菌懸液進行稀釋，依次得到10-2、10-3、10-4 g/mL等濃度的菌懸液。用稀釋平板法在牛肉膏蛋白胨培養基中分離其中的細菌，將分離所得菌株經過純化轉接到牛肉膏蛋白胨培養基的試管斜面，保存于4 ℃冰箱中。

1.5產IAA菌株的篩選

1.5.1產IAA菌株的初篩將分離純化后的菌株接種于L-色氨酸濃度為100 mg/L的LB液體培養基中，30 ℃、180 r/min 條件下搖床培養24 h。取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入等量Salkowski顯色液進行顯色反應，以加入50 μL培養基作為陰性對照。白色陶瓷板于室溫、避光條件下放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠產IAA。顏色越深，表示分泌的量越大，不變色為陰性，表示不能分泌IAA。

1.5.2定量復篩

1.5.2.1IAA標準液及標準曲線的制備標準液的制備：準確稱取IAA（精確至0.001 mg）用流動相定容，并進行超聲處理數秒鐘使其充分溶解，轉移到棕色試劑瓶中，置于4 ℃冰箱備用。

制備具有一定濃度梯度的不同IAA溶液，按照所選擇的色譜條件進樣20 μL，獲得不同濃度時IAA的峰面積。根據峰面積（y）和對應的IAA標準品濃度（x，mg/kg）繪制標準曲線，并得出線性方程、相關系數。

1.5.2.2菌液中IAA濃度的測定活化待測菌株，接種于LB液體培養基中，培養24 h后取出，8 000 r/min離心 15 min，然后取各上清液過微孔濾膜，待儀器穩定后，用微量進樣器進樣，進樣量為20 μL。根據標樣中各組分的保留時間確定樣品中的IAA組分，并根據峰面積計算IAA含量。

1.6產IAA菌株白菜盆栽試驗

1.6.1試驗時間、地點試驗于2015年1—3月在山東金正大生態工程集團股份有限公司研發中心的智能玻璃溫室中進行。

1.6.2試驗材料供試白菜（Brassica campestris L.）品種為蘇州青，種子由山東昌邑市蔬菜研究所提供；供試底肥為氮 ∶磷 ∶鉀=15 ∶15 ∶15的硝基復混肥；供試土壤為棕壤，有機質含量12.3 g/kg。

1.6.3試驗設計試驗共5個處理（表1），每個處理4盆，每盆裝土5 kg，硝基復混肥作為底肥1次性施入土壤，每盆施入1.33 g。白菜2葉1心時間苗，每盆保留生長一致、均勻分布的4株作為試驗株，管理措施一致?？瞻捉M接種清水為對照（CK1），處理組接種菌株的發酵液（108 CFU/mL）。處理1在盆栽中接種0.5 mL滅活菌株發酵液（T1），處理2接種 0.5 mL 未滅活菌株發酵液（T2），處理3在盆栽中接種 1.0 mL 滅活菌株發酵液（T3），處理4接種1.0 mL未滅活菌株發酵液（T4）。每組設4個重復試驗，重復接種2次，間隔為15 d，其間適時定量澆水，試驗周期58 d。收獲時測定葉片SPAD值、葉片數和鮮質量、干質量[6-7]。

1.6.4葉片數、生理指標測定葉片數的統計只選擇綠色可食用部分；SAPD值測定采用SPAD-502Plus型葉綠素儀；干質量測定按常規方法進行[8]。

1.6.5數據分析試驗數據采用Excel進行處理，利用SPSS 16.0軟件進行數據統計及差異顯著性分析。

1.716SrDNA序列分析鑒定

IAA產生細菌16S rDNA PCR擴增參考謝永麗等的方法[9]。將16S rDNA擴增產物回收純化后測序，測序所得序列通過NCBI數據庫進行BLAST比對。

2結果與分析

2.1產IAA細菌的分離和篩選

分離純化得到細菌共計38株，初篩12株產IAA的菌株，經過定性初篩和定量復篩，獲得1株具有較好的產IAA能力的細菌，其發酵24 h產IAA水平達到48 mg/L以上，將其命名為HB-1。

2.2菌株HB-1的室內促生試驗

2.2.1菌株HB-1對白菜葉綠素含量、葉片數的影響從圖1看出，在SPAD值上，各菌劑處理均高于CK，最高的是T4處理，比CK高5.02%，且差異極顯著（P<0.01），其次是T2處理，比CK高2.97%，差異明顯。從葉片數來看，各處理均高于CK，且差異明顯，其中T4處理比CK高15.78%，且差異極顯著（P<0.01）。

2.2.2菌株HB-1對白菜鮮質量、干質量的影響圖2顯示，所有菌劑處理的鮮質量、干質量較沖施清水的對照（CK）相比都增加，與CK相比，添加HB-1發酵液的各個處理鮮質量增加1.54～17.98 g，增幅達到1.16%～13.55%，差異達到顯著水平，其中施加1.0 mL/盆等體積發酵液較滅活發酵液鮮質量增加11%；添加HB-1發酵液的各個處理干質量增加0.26～1.32 g，增幅達到2.97%～14.92%，其中未滅活的T4處理干質量、鮮質量增幅最高，與CK相比鮮質量平均增加 17.98 g，增幅達到13.55%，差異達到極顯著水平，干質量平均增加1.32 g，增幅達到14.92%，差異達到極顯著水平。滅活的發酵液處理T1、T3較清水對照也有不同程度的增產，分析原因，可能是發酵液中殘留養分促進了白菜生長。結果表明，在施加底肥的基礎上施用HB-1發酵液，可以顯著提高白菜的生物產量。

2.316S rDNA測定結果

對菌株HB-1的16S rDNA基因部分序列進行BLAST

比對，利用MEGA 4.1的Neighbor-Joining軟件進行系統發育樹構建。由圖3遺傳距離可知，菌株HB-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性最高（99.7%），與其他菌株的遺傳距離相對較遠，可以確定菌株HB-1是1株枯草芽孢桿菌。

3討論與結論

從番茄根際土壤中分離篩選獲得1株具有較好產IAA能力的革蘭氏陽性菌株HB-1，其發酵24 h產IAA水平達到48 mg/L以上。通過將其培養后的發酵液進行白菜的促生試驗表明，與沖施清水的處理相比，沖施滅活HB-1發酵液與未滅活發酵液對白菜均有促生作用，施加HB-1發酵液的處理葉綠素含量、葉片數均高于對照（CK）；鮮質量、干質量較CK相比都增加，鮮質量增加1.54～17.98 g，增幅達到116%～13.55%，差異達到顯著水平；干質量增加0.26～1.32 g，增幅達到2.97%～14.92%。沖施1.0 mL未滅活發酵液處理較空白處理鮮質量可提高13.55%，差異達到極顯著水平；沖施0.5 mL未滅活發酵液處理較空白處理鮮質量可提高6.48%，差異達到顯著水平。試驗結果表明，菌株HB-1具有較強的促生作用。通過對菌株的16S rDNA序列的測定和分析，鑒定菌株HB-1為枯草芽孢桿菌。

枯草芽孢桿菌HB-1具有較好的產IAA能力，因為枯草芽孢桿菌具有非常好的生產性能及抗逆、定植能力，因此該菌株篩選為功能微生物肥料的研發提供了較好的選擇。

參考文獻：

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