阿膠抗黑色素生成作用機制研究

項晴 徐繼業 孫霓 閆金紅

（聊城職業技術學院 山東聊城 252000）

皮膚是機體表面最大的組織器官，既具有保護身體、排泄汗液、感覺冷熱和壓力的作用，又能保護體內多種組織器官免受機械性、化學性、物理性及病原微生物的侵襲。皮膚作為人體最外層組織，是機體衰老最直觀的外在表現，分為自然老化和光老化。前者與年齡有關；后者多由于環境因素所致，受紫外線照射、季節變化、生活壓力及疾病等因素影響，皮膚表現為皮格樣改變，并出現明顯的色素沉著。近年來，隨著人們保健意識的逐步增強，對于衰老的研究日益增多。目前，皮膚抗衰老的治療方式很多，而且效果不同，人們的接受方式也不同。天然藥物治療的最大特點是安全且有效，早在《傷寒論》之中就有“豬膚湯”等方劑，至今仍可用于皮膚保養，可見天然藥物延緩皮膚衰老的歷史悠久。醫藥產品用于促進皮膚健康已經有幾個世紀了，護膚品在臨床應用與美容用途方面都有重要的地位，含有天然成分的化妝品已經被廣泛使用。但目前發現的生物活性化合物發展成為新的化妝品仍然是一個重要的挑戰［1-2］。

阿膠為馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠，可促進細胞再生，升高失血性休克者之血壓，改善體內鈣平衡，防止進行性營養障礙，提高免疫功能等［3-5］。已有報道稱其具有抗衰老、抗腫瘤、免疫調節、抗炎等作用［6-7］，但其在皮膚美白方面的研究機制未見報道。本文研究了DHG 在小鼠B16-F10 黑素瘤細胞中的抗黑色素作用，探討了DHG對這些細胞的作用機制，及其在皮膚護理中的應用前景。

1 材料和方法

1.1 材料

阿膠購自東阿阿膠股份有限公司（中國山東），其余試劑均購自Sigma-Aldrich。小鼠黑色素瘤細胞系B16-F10（BCRC60031），來自于研究中心。胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素（P/S）與杜爾貝克的改良Eagle培養基（DMEM）購自Hyclone。

1.2 細胞培養及活力測定

將B16-F10 細胞細胞置于含10% 胎牛血清、50mg/mLP/S 的DMEM 培養基中，37℃、5%CO2培養箱中培養。將B16-F10細胞以5×105個/孔的密度接種于24孔板。用雙蒸餾水或乙醇（1g/10mL）制備DHG提取物。孵育24h后，更換含不同濃度DHG的新鮮培養基，繼續孵育24h，采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯四唑溴鹽（MTT）法測定細胞存活率。用磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）洗滌，代之以MTT溶液，37℃孵育1h。用ELISA 閱讀器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）測定二甲基亞砜（DMSO）溶解的細胞在540nm 的吸光度下形成的甲臜。

1.3 皮膚分析

DHG與生理鹽水（1g/9mL）研磨5min，3000×g離心10min，取上清1mL 加入濾紙（9cm×9cm）中。把含有DHG 或RO 水濾紙放在志愿者的左邊或右邊臉頰上，保持15min，然后用RO水清洗后。用鏡頭紙輕輕擦拭5min，然后用TD-3D 皮膚分析儀測試，分析DHG 對面部皮膚的斑點、皺紋和紋理面部皮膚的影響。

1.4 阿膠溶液對小鼠B16-F10 細胞中酪氨酸酶活性影響測定

由于酪氨酸酶是黑色素形成的重要關鍵，抑制酪氨酸酶是避免黑色素生物合成的常用方法［8］。測定DHG 對B16-F10 細胞酪氨酸酶活性的影響。以10mLDMEM（10%胎牛血清，50mg/mLP/S）完全培養基將（1～3）×105的細胞接種于在24 孔板上，用不同濃度的DHG處理48h。再用裂解緩沖液（0.1MPBS，pH值為6.8，含1%Triton X-100 和蛋白酶抑制劑）收集細胞。然后細胞被冷凍和解凍5 次而破壞。細胞裂解液14000g 離心15min，采用Bradford 法（Bio-Rad，Richmond，CA，USA）測定細胞裂解液上清液中蛋白濃度并歸一化。預熱至37oC后，每個樣品50μl轉移到的96孔板，然后與50μlL-DOPA（11mg/mL）在37oC 反應1h。在30min 內，475nm 處動態測定吸光度，測量酪氨酸酶活性。以摩爾吸光系數為3700（mol/l·cm）-1，來計算酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性單位定義為在標準測定條件下氧化1μMmin-1底物（L-DOPA）所需的酶量。對酪氨酸酶活性的抑制率（%）=（A-B）/A×100%。其中，A為未處理樣品的吸光度，B為DHG處理樣品的吸光度。

1.5 阿膠溶液對小鼠B16-F10細胞中黑色素含量測量

將B16-F10 細胞以5×105mL-1的密度接種于24 孔培養板，在37℃、5%CO2中孵育24h。在100MJ 紫外光照射下，用系列濃度的DHG 處理B16-F10 細胞24h。PBS 洗滌后，冷凍并解凍30min，12 000g 離心30min，60℃用100μl 1N NaOH 溶液處理30min。將80μl 的培養基轉移到微板上，用黑色素標準曲線在405nm 的吸光度下測定黑色素含量。將一份80μl 的培養基轉移到微孔板上，并在405nm處測定吸光度，采用標準曲線測定，測定細胞黑色素含量。

圖2 DHG 處理對酪氨酸酶活性的抑制作用

2 結果

2.1 DHG對細胞活力的影響

研究了DHG對小鼠B16-F10細胞存活率的影響。用MTT法檢測不同濃度處理后細胞的存活率。如圖1所示，水提物中的DHG 濃度為0.5～1.0mg/mL 時，在此范圍內DHG對B16-F10細胞也沒有細胞毒性作用。

圖1 MTT 法檢測DHG 對細胞活力的影響

2.2 DHG對皮膚試驗的影響

用DHG進行簡單的治療，有一定的護膚效果。通過皮膚分析，DHG 治療后面部皮膚紋理、毛孔、皺紋、紅斑明顯改善（見表1）。

表1 DHG 對面部皮膚分析的影響

圖3 DHG 對黑色素生成的抑制作用

2.3 DHG對酪氨酸酶的影響

比較了在100mJUVB照射下DHG處理的B16-F10細胞的酪氨酸酶活性。結果表明，與UVB 組相比，DHG（1mg/mL）兩種提取物對酪氨酸酶活性的抑制均為10.7%～14.1%（見圖2）。

2.4 DHG對B16-F10細胞黑色素含量的影響

為了進一步評價DHG 抗黑素的潛力，測定了在100 MJ UVB 照射下DHG 處理的B16-F10 細胞的黑色素含量。在處理后24h，用405nm的吸光度測量黑色素含量。結果表明，DHG水提液（1mg/mL）對黑色素的抑制活性為16.4%（見圖3）。

3 討論

本研究結果表明，DHG 對B16-F10 黑素瘤細胞的細胞存活率無細胞毒性作用。DHG 通過抑制酪氨酸酶活性，降低B16-F10黑色素細胞黑色素含量，具有抗黑色素生成作用。因此，從驢皮中提取的DHG有可能成為一種抗色素劑。

得出結論：阿膠對細胞沒有細胞毒性，通過抑制酪氨酸酶活性，降低B16-F10黑色素細胞黑色素含量，具有抗黑色素形成作用。