紫杉醇-姜黃素介孔SiO2/脂質復合遞藥系統體外釋藥研究

王 倩 ， 胥輝豪 ， 趙琳娜 ， 林珈好 ， 林德貴

(中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193)

二萜生物堿類化合物紫杉醇(TAX)是活性明確的天然抗癌藥物，在臨床上已廣泛用于乳腺癌、卵巢癌和部分頭頸癌和肺癌的治療[1-5]。姜黃素(CUR)是從姜黃根莖中提取出的脂溶性酚類化合物，具有多種藥理活性，尤其抗腫瘤作用活性明確[6-8]。紫杉醇與姜黃素二者合用的體內外抑癌作用優于任一單成分組[9]，Hossain等[10]研究表明，姜黃素和紫杉醇合用能夠高效活化Caspase-8，促進線粒體釋放細胞色素C、Smac/Diablo和AIF進入腫瘤細胞胞質，促進腫瘤細胞凋亡。二者聯用可大大降低TAX用藥劑量，從而降低毒副作用。紫杉醇-姜黃素介孔SiO2/脂質復合遞藥系統(PLMSNs)具有介孔SiO2比表面積大、裝載藥物多和緩釋等特性的同時，還具有脂質體良好的生物相容性[11-12]。通過對紫杉醇和姜黃素同時載藥，發揮二者協同抗乳腺癌作用，提高二者載藥量、水溶性和穩定性，從而提高其生物利用度，實現高效低毒。為了解自制TAX-CUR-PLMSNs在生理鹽水中的藥物釋放情況，結合高效液相色譜法(HPLC)[13]進行了如下試驗。

1 主要試驗材料與儀器

紫杉醇標準品，姜黃素標準品(中國食品藥品檢定研究院，北京)；無水乙醇，乙腈，冰醋酸，甲酸，生理鹽水(北京化工廠，北京)；viskase MD34MM透析袋、封口夾(北京環科智儀科技有限公司，上海)；KQ-3200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，北京)；Sigma 3-18K 臺式高速冷凍離心機(西格瑪奧德里奇上海貿易有限公司，上海)；德國默克密理博Milli-Q Reference超純水系統(北京德泉興業商貿有限公司，北京)；搖床ZHWY-1102C(上海智誠分析儀器制造有限公司，上海)；島津20A高效液相色譜儀(島津制作所，日本)。

2 試驗方法

2.1 HPLC同時檢測紫杉醇、姜黃素方法學建立 在篩選多種流動相配比方案及洗脫方式后，確定色譜條件如下：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.1%甲酸水溶液；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長: 227 nm；進樣體積：20 μL。分別繪制TAX和CUR標準曲線，并從精密度、重復性、穩定性、回收率等方面進行方法學考察。

2.2 溶解度考察 取紫杉醇和姜黃素標準品配成過飽和溶液，于37 ℃、100 r/min條件下震蕩24 h后離心取上清過濾，高效液相色譜法檢測濃度。

2.3 增溶劑篩選 Robert[14]調研顯示,市售注射劑中吐溫-80的含量如下:肌肉注射≤ 4 %，靜脈推注≤0. 4 %,靜脈滴注≤ 2 %。十二烷基硫酸鈉(SDS)作為增溶劑其濃度亦不宜過高。因此以2%為濃度上限。分別制備濃度為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%十二烷基硫酸鈉的生理鹽水溶液，加入過量紫杉醇、姜黃素，一定條件下震蕩，離心取上清過濾，高效液相法檢測上清濃度。同樣的方法檢測同濃度梯度的吐溫-80對紫杉醇和姜黃素飽和濃度的影響。

2.4 體外釋藥

2.4.1 試驗分組及藥物制備方法 TAX單藥組：稱取3 mg紫杉醇加入到含有10 mL 1.5%吐溫-80的生理鹽水中混勻；CUR單藥組：稱取30 mg姜黃素加入到含有10 mL 1.5%吐溫-80的生理鹽水中混勻；TAX+CUR單藥混合組：稱取3 mg紫杉醇與30 mg姜黃素加入到含有10 mL 1.5%吐溫-80的生理鹽水中混勻；TAX-CUR -MSNs組：稱取紫杉醇3 mg，姜黃素30 mg，于20 mL三氯甲烷溶液中混勻，避光，搖床振蕩19 h后離心，取上清檢測游離TAX、CUR的含量，沉淀置于通風櫥；TAX-CUR -LMSNs組：稱取適量磷脂、膽固醇以及相應劑量的紫杉醇或姜黃素加入圓底燒瓶中，無水乙醇溶解后旋轉蒸發成膜。向TAX-CUR -MSNs組中裝有MSNs沉淀的離心管內加入10 mL超純水，混勻后圓底燒瓶內水合；TAX-CUR -PLMSNs組：在TAX-CUR -LMSNs組基礎上添加PEG-2 000成膜。

2.4.2 反透析法考察TAX-CUR-PLMSNs遞藥系統體外釋藥行為 研究微粒分散體系體外釋藥的方法主要分為四大類：膜擴散技術、取樣與分離技術、原位法和連續流動法[15]。本章通過經膜擴散技術及取樣與分離技術對自制遞藥系統的體外釋放進行研究。采用反透析法進行體外釋藥試驗。半透膜煮沸后加入5 mL釋放介質，兩端封閉。250 mL 釋放容器中加入100 mL釋放介質(4組、5組和6組)加入新制備好的3 mL藥物，混勻后加入封閉好的半透膜。搖床內震蕩，37 ℃，100 r/min。分別于以下時間點取袋內溶液1 mL過濾后高效液相法檢測濃度：0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h。取樣后即刻補充等量釋放介質。

3 結果與分析

3.1 HPLC法同時檢測紫杉醇、姜黃素方法學結果與分析 在2.1所述色譜條件下，紫杉醇在0.6 μg/mL-15 μg/mL 濃度范圍內回歸方程(n=5)為：A = 44018C- 5069.7，R2= 0.9998，15 μg/mL-600 μg/mL濃度范圍內回歸方程(n=5)為：A = 39175C + 190612，R2= 0.9998。姜黃素在1.5 μg/mL-30 μg/mL 濃度范圍內回歸方程(n=5)為：A = 44698C-6311.9，R2= 0.9993，15 μg/mL-600 μg/mL濃度范圍內回歸方程(n=5)為：A = 53627C - 215933，R2= 1.0000。所有濃度范圍內呈良好線性關系。該HPLC 方法檢測紫杉醇、姜黃素，其精密度/重復性(紫杉醇R2=0.81%，姜黃素R2=0.41%)；28 h內穩定性(紫杉醇R2=0.8895%，姜黃素R2=0.8808%)及回收率(紫杉醇高中低3個濃度的R2分別為0.87%、1.03%、1.29%，姜黃素高中低3個濃度的R2分別為1.05%、1.85%、1.89%)均符合相關要求。綜上，建立了特異性、準確性、穩定性良好且可重復的同時檢測紫杉醇、姜黃素濃度的高效液相法。

3.2 溶解度考察結果與分析 紫杉醇、姜黃素二者濃度均低于高效液相色譜的最低檢測限0.6 μg/mL。說明紫杉醇和姜黃素在生理鹽水中溶解度極低，不適合單獨用于體外釋藥試驗。

3.3 增溶劑篩選結果與分析 見表1。

表1 不同濃度SDS和吐溫-80對紫杉醇和姜黃素飽和濃度的影響

從表1可以看出， SDS對紫杉醇的增溶效果顯著優于吐溫-80，但是對于姜黃素增溶效果不及吐溫-80；本課題組已經通過細胞試驗確定姜黃素、紫杉醇最佳協同劑量比為6∶1，從增溶劑篩選結果可知吐溫-80濃度為1.5%時可以達到該條件，同時又能滿足體外釋藥的漏槽條件。

3.4 體外釋藥試驗結果與分析 計算每個取藥時間點的累積釋藥濃度并繪制曲線，結果見圖1、圖2。

兩種藥物釋藥行為共同之處主要包括以下兩個方面：第一，單藥組累積釋藥量高于混合組；第二，自制遞藥系統累積釋藥量高于裸藥組。將遞藥系統中的紫杉醇、姜黃素釋放曲線分別用數學模型進行擬合，擬合結果見表2。

圖1 各組不同時間點紫杉醇的累積釋藥 曲線 (n=3)

圖2 各組不同時間點姜黃素的累積釋藥曲線 (n=3)

表2 PLMSNs組紫杉醇累積釋放率動力學模型擬合結果

表3 PLMSNs組姜黃素累積釋放率動力學模型擬合結果

遞藥系統中的紫杉醇和姜黃素兩個指標成分的Hixon-Crowell模型擬合釋放曲線如圖3。

圖3 PLMSNs組紫杉醇Hixon-Crowell模型釋放曲線

圖4 PLMSNs組姜黃素Hixon-Crowell模型釋放曲線

由圖3、圖4模型擬合釋放曲線可知，紫杉醇-姜黃素介孔SiO2/脂質復合遞藥系統中的紫杉醇和姜黃素釋藥行為均與Hixon-Crowell 模型擬合程度最高，相關系數 R2均大于 0.99。

4 結果與討論

吐溫-80是一種非離子型表面活性劑，其增溶效果歸因于其能在水中形成膠團(膠束)[16-17]。作為增溶劑可以提高紫杉醇和姜黃素在生理鹽水中的溶解度，但是裸藥組藥物進入搖床震蕩時大部分以被吐溫膠束包裹的形式均勻分布于釋放介質中，整個過程中只有少量藥物從釋放介質中穿過透析袋進入到袋內，由此檢測到的藥物濃度比較低，對應的釋放速度和累積釋放量也較低。

由此可推測自制遞藥系統中的紫杉醇和姜黃素緩慢從介孔二氧化硅載體釋出經過釋放介質穿過透析袋進入袋內介質中。兩種藥物釋藥行為不同之處主要在于3種遞藥系統之間的差別。紫杉醇累積釋藥量由高到低分別為：MSNs>PLMSNs>LMSNs，姜黃素累積釋藥量由高到低分別為：LMSNs>PLMSNs>MSNs。其中針對紫杉醇而言，MSNs表面沒有包被任何物質，紫杉醇從孔道內逐漸釋放，沒有受到來自磷脂層或PEG-2000的阻礙作用，因此釋藥量高于PLMSNs組和LMSNs組。PLMSNs藥物表面PEG-2000作為一種親水性基團有利于釋放介質進入孔道中，促進藥物的釋放。針對姜黃素，MSNs表面沒有包被任何物質，姜黃素從孔道內逐漸釋放，雖未受到來自磷脂層或PEG-2000的阻礙作用，但是姜黃素初始劑量大，被吐溫-80所形成的膠團包裹在內部，因此檢測到的濃度低于LMSNs組和PLMSNs組。PLMSNs表面的PEG-2000水溶性促進效果不及電荷效應對姜黃素釋出的影響。

整體來看紫杉醇和姜黃素的體外釋放行為，紫杉醇的釋放量要遠遠高于姜黃素，這與兩者的結構特性及其與釋放介質的不同作用有關。

5 結論

紫杉醇-姜黃素介孔 SiO2/脂質復合遞藥系統中紫杉醇和姜黃素的釋放行為符合溶蝕作用控制的多成分均衡釋放模式[16]，成分之間相輔相成、相互協調，體現了其整體釋放行為。

[1] 史清文. 天然藥物化學史話:紫杉醇[J]. 中草藥,2011,42(10):1 878-1 884.

[2] Aigner J, Marme F, Smetanay K,etal. Nab-PacliTAXel monotherapy as a treatment of patients with metastatic breast cancer in routine clinical practice[J]. Anticancer Res, 2013,33(8):3 407-3 413.

[3] Gluck S. nab-PacliTAXel for the treatment of aggressive metastatic breast cancer[J]. Clin Breast Cancer, 2014,14(4):221-227.

[4] Gou Q, Lei L, Wang C,etal. Polymeric nanoassemblies entrapping curcumin overcome multidrug resistance in ovarian cancer[J]. Colloids & Surfaces B Biointerfaces, 2015, 126: 26-34.

[5] Gao X, Wang B, Wu Q,etal. Combined delivery and Anti-cancer cctivity of paclitaxel and curcumin using polymeric micelles[J]. Journal of Biomedical Nanotechnology, 2015, 11(4):578-589.

[6] 馮為, 胡林峰. 姜黃素的研究進展及其抗腫瘤作用概況[J]. 中國現代藥物應用, 2011(13):117-118.

[7] Kunnumakkara A B, Diagaradjane P, Anand P,etal. CURcumin sensitizes human colorectal cancer to capecitabine by modulation of cyclin D1, COX-2, MMP-9, VEGF and CXCR4 expression in an orthotopic mouse model[J]. Int J Cancer, 2009,125(9):2 187-2 197.

[8] Bayet-Robert M, Kwiatkowski F, Leheurteur M,etal. Phase I dose escalation trial of doceTAXel plus CURcumin in patients with advanced and metastatic breast cancer[J]. Cancer Biol Ther, 2010,9(1):8-14.

[9] Gao X, Wang B, Wu Q,etal. Combined Delivery and Anti-Cancer Activity of PacliTAXel and CURcumin Using Polymeric Micelles[J]. J Biomed Nanotechnol, 2015,11(4):578-589.

[10] Hossain M, Banik N L, Ray S K. Synergistic anti-cancer mechanisms of CURcumin and pacliTAXel for growth inhibition of human brain tumor stem cells and LN18 and U138MG cells[J]. Neurochem Int, 2012,61(7):1 102-1 113.

[11] Rahimi Hamid Reza,Nedaeinia Reza,Sepehri Shamloo Alireza,etat. Novel delivery system for natural products: Nano-curcumin formulations[J]. Avicenna journal of phytomedicine,2016,64.

[12] Liu, Z. Evaluation of the efficacy of paclitaxel with curcumin combination in ovarian cancer cells[J]. Oncol Lett, 2016, 12(5): 3 944-3 948.

[13] 王扣瓊, 邵文琦, 彭穎斐, 等. 液相色譜-串聯質譜法檢測血漿紫杉醇性能評價[J]. 檢驗醫學, 2016(05):394-398.

[14] Strickley R G. Solubilizing excipients in oral and injectable formulations[J]. Pharm Res, 2004,21(2):201-230.

[15] Pedram Rafiei,Azita Haddadi. Pharmacokinetic Consequences of PLGA Nanoparticles in DoceTAXel Drug Delivery[J]. Pharmaceutical Nanotechnology,2017,51.

[16] 孫會敏,楊銳,欒琳,等. 聚山梨酯80質量分析與致敏原探究[J]. 藥物分析雜志,2011,31(10):1 850-1 855.

[17] 吳毅,金少鴻. 藥用輔料吐溫 80的藥理、藥動學及分析方法研究進展[J]. 中國藥事,2008,22(08):717-720.