豬繁殖與呼吸綜合征疫情與豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因型的相關性研究

馬晶晶, 高俊鋒， 吳碧清， 韓相敏， 李桃梅， 賴 志

(1.上海創宏生物科技有限公司 ， 上海 松江 201619 ； 2.上海伊科拜克獸藥銷售有限公司 ， 上海 長寧 201101)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) 是一種嚴重影響全球養豬業的重要病原，可給養豬生產造成巨大經濟損失，所致疫病為豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)，在我國俗稱“豬藍耳病”，以母豬繁殖障礙和生長豬的呼吸道疾病為特征[1]，主要表現為母豬發熱、厭食和早產、流產、產死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙，新生及斷奶前仔豬高死亡率[2-3]。

PRRSV為單股正鏈RNA病毒，約15 kb，有9個開放閱讀框，極易變異和演化，呈現毒株的多樣性與致病性[4]，特別是高致病性毒株和流行新毒株的不斷出現，以及豬場PRRS活疫苗的不正確使用，使疫病的局部暴發和再流行趨勢蔓延。PRRSV 基因組的變異主要集中于非結構蛋白 Nsp2編碼區、結構蛋白ORF5和ORF3基因；結構蛋白ORF7則是相對保守的區段[5]。本試驗旨在通過田間試驗的臨床觀察和生產統計結合分子生物學方法分析豬場PRRSV疫情與豬群存在PRRSV基因型的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗豬場 某南方養殖場生產3線，生產母豬900頭。2014年5月開始出現產房母豬高燒、流產和產不合格仔豬(不合格仔豬指死胎、木乃伊胎和弱仔，弱仔標準：初生個體重<0.7 kg)。平均胎產不合格仔豬數為2.45頭/窩。6月份母豬流產增加，達18窩/周。對豬場使用藍耳病疫苗情況進行調查發現：自2012年先后使用過V2332活疫苗、JXA-1R株活疫苗、自家苗(滅活疫苗)。目前，使用TJM-F92株活疫苗。

1.1.2 主要試劑 泰萬菌素，購自浙江伊科拜克動物保健品有限公司；病毒基因組提取試劑盒，購自北京天根生物科技有限公司；PCR試劑耗材，購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據豬瘟病毒(CSFV)、細小病毒(PPV)、圓環病毒2型(PCV-2)、偽狂犬病病毒(PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因組設計診斷引物；根據PRRSV NSP2區段的基因序列特征設計鑒別引物，退火溫度和擴增片段見表1。

1.2.2 PCR或RT-PCR檢測 取胎衣、臍帶血和流產胎兒肺等病料，按照試劑盒說明書提取病毒DNA和RNA，RNA反轉錄為cDNA。取提取的DNA和反轉錄的cDNA用PRRSV、細小病病毒、圓環病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟引物進行PCR擴增，并將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 檢測引物序列

1.2.3 用藥 在試驗豬場飼料中添加泰萬菌素進行飼喂，用藥時間和劑量見表2。

表2 試驗用藥方案

1.2.4 生產數據記錄 從用藥前14 d至用藥后98 d，以7 d為周期，對母豬流產數、胎產不合格仔豬數、胎產全死胎、木乃伊胎母豬數和保育舍死淘仔豬數等生產數據進行統計。

1.2.5用藥后不同類型毒株PRRSV檢測 按表3所示，采樣方案分別采集胎衣、臍帶血、流產胎兒肺等病料和血清，分別按照試劑盒說明書提取病毒RNA，反轉錄為cDNA，用PRRSV鑒別引物進行擴增，記錄病料和血清中PRRSV經典毒株、高致病性野毒、高致病性疫苗毒所占比例，并分析所有檢測項目中經典PRRSV經典毒株、高致病性野毒、高致病性疫苗毒所占比例。

表3 試驗采樣方案

2 結果

2.1 流產原因診斷結果 通過對病料組織及血清PCR檢測，檢測結果細小病病毒、圓環病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒均為陰性，PRRSV為陽性。從而可以判定PRRSV是引起這次流產的主要病原。

2.2 流產母豬統計結果 用藥后，流產母豬數從用藥前的18頭/周下降至用藥后7 d的2頭/周，21 d降至0頭/周(見圖1)。

2.3 胎產不合格仔豬數統計結果 用藥前母豬胎產不合格仔豬數在2.24～2.45頭/胎，用藥時為3.63頭/胎；隨著用藥時間推移，胎產不合格仔豬數逐步下降，到用藥35 d時下降至1.32頭/胎；用藥84 d時降為0.78頭/胎(見圖2)。

2.4 胎產全死胎、黑胎母豬數統計結果 用藥前胎產全死胎、木乃伊胎母豬數為4～7頭，用藥后35 d降為0，并持續到試驗結束(見圖3)。

2.5 保育死亡淘汰豬數量統計結果 用藥前14 d保育死亡淘汰豬為47頭，用藥后21 d降為17頭，隨后一直穩定在10～20頭之間，直至試驗結束(見圖4)。

2.6 RT-PCR檢測試驗結果

2.6.1 所有樣品RT-PCR檢測結果 從用藥前至用藥后90 d， PRRSV總陽性率從85.7%下降至14.3%；經典毒和野毒陽性率均逐漸下降，至用藥后70 d檢測結果均為陰性；PRRSV疫苗毒株從42.9%下降至14.3%。高致病性野毒陽性率趨勢圖見圖5，毒株比重趨勢圖見圖6。PRRSV疫苗毒株經鑒定為藍耳病疫苗毒株天津株。見圖5、6、7。

圖1 用藥前后流產母豬統計

圖2 用藥前后胎產不合格仔豬統計

圖3 用藥前后胎產全死胎、黑胎母豬數量統計

圖4 用藥前后保育豬死淘數統計

圖5 所有樣品各批次野毒陽性率趨勢

圖6 所有樣品各批次毒株比重趨勢

圖7 病料和血清毒株PRRSV鑒別診斷RT-PCR擴增

1：20140905病料樣品 ； 2：20140905血清樣品 ； 3：PRRSV天津株 ；N：陰性對照 ； M：DL-2 000 DNA Marker

2.6.2 血清、病料樣品RT-PCR分檢測結果 用藥前血清樣品中總陽性率為42.9%，用藥后30 d為2.9%，隨后趨于穩定；經典毒、高致病性野毒和高致病性疫苗毒在用藥后30 d陽性率≤2.9%。

用藥前病料樣品中總陽性率為42.9%，用藥后≤28.6%；經典毒、高致病性野毒在用藥后50 d至試驗結束時均≤5.7%；高致病性疫苗毒在用藥后陽性率無顯著變化，見圖8。

圖8 病料、血清樣品RT-PCR檢測結果

3 討論

近年來，在免疫過PRRSV的豬場仍暴發PRRS的報道呈增加趨勢，給豬場帶來了很大的經濟損失。研究發現，表明PRRSV的重組或變異與各類型PRRSV的種類及病毒血癥周期長短有一定關系[8]。

本試驗選擇在免疫過多種疫苗，而母豬仍出現高燒、流產和產不合格仔豬的豬場進行。檢測發現，該豬場存在PRRSV經典毒、高致病性野毒和高致病性疫苗毒3種毒株亞型。有研究報道，泰萬菌素對PRRSV有抑制作用[6-7]，本試驗對母豬飼喂泰萬菌素后，PRRSV毒株亞型數減少，同時母豬流產數、胎產不合格仔豬數、胎產全死胎、木乃伊胎母豬數和保育舍死淘數均呈下降趨勢，逐漸趨于平穩，表明豬群感染PRRSV基因類型越單一，豬群越平穩。

PRRSV的變異性會導致致病性增強的新毒株出現，一旦成為優勢毒株將造成PRRS的暴發。新近的研究表明，從一些發生PRRS的豬場分離到與 HP-PRRSV減毒活疫苗病毒高度同源的毒株，且分離毒株呈現對豬的致病性增強，為這一現象提供了有力的證據[9]。目前，我國 PRRSV減毒活疫苗應用廣泛，疫苗病毒的回復突變和毒力返強以及與野毒株重組的現象成為豬場新的PRRS防控難題。因此，在防控PRRS時，活疫苗種類不可盲目貪多，減毒活疫苗的合理使用十分必要[11]，這不僅有利于有效阻止疫苗病毒的演化和毒力回復返強，而且可降低疫苗病毒與野毒重組而產生新毒株的幾率，并延緩 PRRSV變異和演化的速度[8, 10]。

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