55株雞胚源沙門菌的耐藥性分析及ESBLs基因檢測

徐耀輝 ， 鄧同煒 ， 齊亞如 ， 韓文龍 ， 韓雨奇 ， 蔣增海 ， 盧建洲

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

禽沙門菌病是一類重要的禽傳染病，可以造成幼雛大量死亡、蛋雞產(chǎn)蛋率下降、種蛋孵化率、出雛率下降，弱雛率增加，該病具有水平傳播和垂直傳播的特性，對家禽業(yè)危害巨大。該類病分為3種類型：雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒，對應(yīng)的病原分別為雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌，以及由雞白痢沙門菌與雞傷寒沙門菌之外的其他沙門菌。其中雞白痢沙門菌和禽傷寒沙門菌有宿主特異性，主要感染家禽，而禽副傷寒能廣泛感染各種動(dòng)物和人，在自然界中家禽是其重要的貯存宿主。同時(shí)沙門菌也是世界上食源性腹瀉最常見的病原菌之一，在引起人類食源性腸胃炎的細(xì)菌中，沙門菌占第一或第二位[1]。

我國是抗菌藥物最大的生產(chǎn)和使用國。抗菌藥物在養(yǎng)殖領(lǐng)域?qū)τ诜乐蝿?dòng)物疫病和提高養(yǎng)殖效益等方面發(fā)揮重要作用。但近年來細(xì)菌耐藥事件頻頻發(fā)生，細(xì)菌耐藥已成為一個(gè)嚴(yán)峻的全球性問題。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，是一種絲氨酸蛋白酶衍生物，能滅活三代頭孢菌素和氨曲南等β-內(nèi)酰胺類藥物，但對酶抑制劑、碳青霉烯類和頭霉烯類抗生素敏感，根據(jù)質(zhì)粒編碼基因和ESBLs優(yōu)先水解底物的不同可將其分為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型等，其中以TEM、SHV、CTX-M型最為常見。本研究對河南某種雞場自帶孵化場在孵化后期死亡的雞胚進(jìn)行調(diào)查，了解沙門菌在雞胚中的感染情況，并對所分離的沙門菌耐藥性和ESBLs基因進(jìn)行檢測，分析ESBLs陽性菌株的耐藥表型與基因型的關(guān)系，為沙門菌的ESBLs分子流行特征的研究及有效防制禽沙門菌病提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL-2 000，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；普通營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂，均購自北京奧博星有限責(zé)任公司；MH瓊脂，購自英國Oxoid公司；沙門菌屬診斷血清，購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；麥?zhǔn)媳葷峁埽徸詮V東環(huán)凱微生物科技有限公司；所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 藥敏紙片 試驗(yàn)所用的藥敏紙片有氨基糖苷類的卡那霉素(K)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)，青霉素類的氨芐西林(AMP)，β內(nèi)酰胺抑制物類的阿莫西林克拉維酸(AMC)，頭孢菌素類的頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑林(KZ)、頭孢噻呋(EFT)，碳青霉烯類的美羅培南(MEM)、亞胺培南(IPM)，單環(huán)β內(nèi)酰胺類的氨曲南(ATM)，四環(huán)素類的四環(huán)素(TE)、土霉素(OT)，多肽類的多粘菌素B(PB)，酰胺醇類的氯霉素(C)，喹諾酮類的恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)，磺胺類的磺胺甲惡唑(SXT)、磺胺異惡唑(SF)，硝基呋喃類的呋喃妥因(F)，均購自英國Oxoid公司；頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸，頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸，均購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸桿菌ATCC25922，雞白痢標(biāo)準(zhǔn)株C79-13，腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株50041由揚(yáng)州大學(xué)人獸共患病學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 細(xì)菌的分離與PCR鑒定 從河南省某父母代麻雞孵化場采集死胚共120份，無菌取雞胚肝臟、脾臟、卵黃液在S.S.瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取疑似沙門菌菌落進(jìn)行純化、培養(yǎng)；然后運(yùn)用煮沸法提取細(xì)菌DNA，針對沙門菌腸毒素STN基因設(shè)計(jì)引物[2]進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的細(xì)菌再用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)一步鑒定。

2.2 血清型鑒定 將鑒定為陽性的沙門菌進(jìn)行動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，以腸炎沙門菌和雞白痢標(biāo)準(zhǔn)株為對照，可知無動(dòng)力的分離株為雞白痢或雞傷寒沙門菌，有動(dòng)力的為禽副傷寒沙門菌，對于禽副傷寒沙門菌可通過玻片凝集法進(jìn)行血清型分型，根據(jù)Kauffmann-White抗原表[3]檢索沙門菌分離株的血清型。以生理鹽水為陰性對照，排除自凝現(xiàn)象。

2.3 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),具體參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)手冊進(jìn)行[4]，以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，測定分離菌株的藥物敏感性。

2.4 產(chǎn)ESBLs菌株的篩選及確證試驗(yàn) 參照藥敏試驗(yàn)結(jié)果，篩選出抑菌圈直徑，頭孢他啶≤22 mm，氨曲南≤27 mm，頭孢曲松≤25 mm，3種藥物符合任意一種的菌株，然后對篩選出來的菌株，運(yùn)用雙紙片協(xié)同測試法[5]，將頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸，頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸4個(gè)藥敏紙片貼于涂有待檢菌的MH瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng) 16～18 h后，測量抑菌圈直徑，兩個(gè)藥物中任何一個(gè)，在加克拉維酸后，抑菌圈直徑與不加克拉維酸時(shí)的抑菌圈直徑相比，增大值≥5 mm時(shí)，判定該菌產(chǎn)ESBLs。

2.5 ESBLs基因的PCR檢測 根據(jù)文獻(xiàn)上[6]已發(fā)表的沙門菌的12對ESBLs基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLSAT比對，確保引物序列正確無誤，分別合成了12對特異性引物。PCR反應(yīng)體系20 μL，常規(guī)PCR反應(yīng)條件，各個(gè)基因的退火溫度見表1，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。若與預(yù)期條帶大小一致即為陽性。將PCR陽性產(chǎn)物均送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，將測序結(jié)果再次進(jìn)行BLAST比對，確認(rèn)所檢測的基因。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及引物

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 從120枚死胚共分離到55株沙門菌，分離率為45.83%；經(jīng)血清學(xué)鑒定，共有6種血清型(見表2)。

表2 55株沙門菌血清分型結(jié)果及其分離率

3.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 55株沙門菌分離株對磺胺異惡唑耐藥率最高(76.36%)，所有菌株對美羅培南、亞胺培南均敏感；對氯霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星較敏感(耐藥率1.82%)；且副傷寒沙門菌的耐藥情況明顯嚴(yán)重于雞白痢沙門菌，見表3。

表3 沙門菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表4可以看出，55株沙門菌分離株的多重耐藥情況嚴(yán)重，最多可對八類15種抗菌藥物耐藥，其中二耐、三耐菌株的耐藥率為1.82%～20%，最為嚴(yán)重的是耐氨基糖苷類-青霉素類-頭孢類-磺胺類的四耐菌株，所占比例高達(dá)30.91%。

表4 沙門菌的耐藥譜

3.3 ESBLs菌株的耐藥情況及其基因的檢出情況 運(yùn)用雙紙片協(xié)同法進(jìn)行ESBLs篩選和確證試驗(yàn)，結(jié)果表明，產(chǎn)ESBLs菌株為16株，陽性率(29.09%)較高，且ESBLs陽性菌株對氨基糖苷類、青霉素類、頭孢菌素類和磺胺類的耐藥率均為100%，其耐藥情況明顯嚴(yán)重于ESBLs陰性菌株，詳見表5。經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序、序列比對，16株ESBLs陽性菌株只檢出TEM一種耐藥基因，檢出率為100%，其余11種均未檢出。

4 討論

4.1 沙門菌的分離情況及耐藥性分析 試驗(yàn)從某自帶孵化場的種雞場采集120個(gè)死胚，共分離鑒定出55株沙門菌，檢出率為45.83%，包含6種血清型，表明該場的沙門菌病流行嚴(yán)重且血清型復(fù)雜。其中雞白痢沙門菌25株，占45.45%；禽副傷寒沙門菌30株，占54.55%；副傷寒沙門菌不僅對雞只危害大，污染了雞肉、雞蛋后，對人的潛在威脅也很大，需要引起重視。

藥物的選擇性壓力是造成細(xì)菌耐藥的主要原因。雞場抗菌藥物的大量使用，使沙門菌的抗藥性日益嚴(yán)重。本研究中，分離的雞白痢沙門菌與禽副傷寒沙門菌均產(chǎn)生了較嚴(yán)重的耐藥性，但二者對不同藥物的耐藥程度不同。在21種藥物中，副傷寒沙門菌對9種藥物的耐藥率顯著超過雞白痢沙門菌，分別為卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢曲松、頭孢唑啉、磺胺甲惡唑、磺胺異惡唑，兩者間耐藥差異可能與副傷寒沙門菌的傳播宿主更廣泛，循環(huán)更復(fù)雜有關(guān)。本研究中所有沙門菌對四環(huán)素、土霉素的耐藥率不高，可能與用藥習(xí)慣的不同有關(guān)；對氨基糖苷類、青霉素類及磺胺異惡唑耐藥率較高，在51.85%～75.93%之間，臨床上應(yīng)減少使用這些藥物，避免產(chǎn)生更加嚴(yán)重的耐藥性；對于畜禽禁止使用的氯霉素、氨曲南、美羅培南、亞胺培南耐藥率低，其中氯霉素是由于副作用過大，世界各國在所有食品動(dòng)物上幾乎都已禁止使用，氨曲南、美羅培南、亞胺培南只允許在人醫(yī)上使用，在獸醫(yī)上為禁用藥。表明加強(qiáng)獸藥管理可以減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

表5 產(chǎn)ESBLs和不產(chǎn)ESBLs菌株的耐藥情況的比較

4.2 ESBLs陽性菌株耐藥性分析及ESBLs基因流行特征 通過ESBLs的初篩和確證試驗(yàn)可知，ESBLs陽性菌有16株，占分離總沙門菌株數(shù)量的29%，比楊玲報(bào)道的從豬肉中分離到的沙門氏菌中ESBLs陽性菌占17.46%高[7]。ESBLs陽性菌的耐藥情況明顯比ESBLs陰性菌嚴(yán)重，其中差別最大的是頭孢菌素類抗菌藥，除頭孢他啶外，ESBLs陽性菌對其他3種頭孢類的耐藥率為100%，而ESBLs陰性菌的耐藥率僅為5.13%，其次是青霉素類的氨芐西林，耐藥率相差50%左右，對其余β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率差異不明顯，且耐藥率均比較低，這些藥可能為該養(yǎng)殖場不常用的抗菌藥。ESBLs陽性菌株不僅對頭孢菌素類、青霉素類耐藥，還對氨基糖苷類、磺胺類交叉耐藥，對這四類藥物的多重耐藥率為100%；與有關(guān)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的ESBLs陽性菌株往往表現(xiàn)為嚴(yán)重的多重耐藥性相符。ESBLs可水解碳青霉烯類以外的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，比如能水解青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類及β內(nèi)酰胺酶抑制物類，降低它們的療效；因此，即使體外藥敏試驗(yàn)敏感，對于ESBLs陽性菌也不可使用青霉素、一、二、三代頭孢菌素、氨曲南和阿莫西林克拉維酸[9]。因此，在臨床用藥時(shí)，為了更加高效的治療疾病，需要藥敏試驗(yàn)與ESBLs確證試驗(yàn)相結(jié)合，合理選用抗菌藥物；同時(shí)，應(yīng)注意臨床不能長期固定使用某幾種抗菌藥物，應(yīng)交替輪換用藥；當(dāng)一種藥物無效時(shí)不應(yīng)更換使用同類藥物，以避免交叉耐藥。

動(dòng)物源沙門菌中的ESBLs基因型眾多，在全球范圍內(nèi)流行，不同國家、地區(qū)的基因型流行特征存在差異。北美國家食品動(dòng)物源性沙門菌以TEM和PSE型ESBLs基因?yàn)橹鳎瑲W洲國家以CTX-M型為主，而中國則以TEM、CTX-M、CMY-2及OXA型為主，SHV型檢出率相對較低[10]。國內(nèi)報(bào)道的ESBLs基因流行特征的相關(guān)研究大多數(shù)為大腸桿菌的檢出情況，而本研究中16株ESBLs表型陽性的菌株均檢測出TEM (100%) ESBLs基因，其余11種ESBLs基因均未檢出，表明本場沙門菌ESBLs陽性菌株以TEM基因型為主。由于本次研究只調(diào)查了河南省一個(gè)麻雞種雞場，有一定的局限性，不能代表整個(gè)河南省沙門菌的耐藥情況及ESBLs基因的流行特征，但從此次調(diào)查可以看出，ESBLs陽性菌株檢出率較高，耐藥情況已十分嚴(yán)重，由于ESBLs可水解碳青霉烯類以外的β-內(nèi)酰胺酶類抗生素，有極強(qiáng)的耐藥性，且耐藥細(xì)菌可通過食物鏈傳播給人類，在臨床用藥時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎用藥，切莫為了短期效益使用禁用獸藥，給人類帶來巨大威脅。

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