羊口瘡病毒廣東大浦株的分離鑒定及其遺傳進化分析

郭璐璐 ， 崔言順

(山東農業大學動物科技學院 ， 山東 泰安 271018)

由口瘡病毒(ORFV)引起的羊口瘡是危害嚴重的人獸共患病之一，該病主要發生在綿羊、山羊和多種野生動物[1]，直接接觸動物或接觸被ORFV污染的物品是人類感染的重要原因，該病幾乎在世界上所有養羊的國家都有發生。該病死亡率不高，但由于發病部位特殊嚴重影響被感染動物的采食及生產性能。王晴楠等[2]對我國1984-2014年羊口瘡報道文獻的統計分析表明，該病在我國24個省份都有發生，西北、東北及西南地區為該病的重災區，此外，山東、廣東、云南等地也出現該病的發生和流行。口瘡病毒(ORFV)屬于痘病毒科脊索亞科副痘病毒屬的嗜上皮型雙鏈DNA病毒，病毒粒子呈磚形或橢圓形，其表面呈繩索樣縱橫交錯排列結構[3]。到目前為止，分離鑒定并獲得全基因組序列的ORFV毒株基因組長度不一[4-5]，G+C含量高達64%，都編碼132個基因，在基因組的兩側末端區域的閱讀框有很大差異，這些差異也許是ORFV毒力和免疫逃逸功能差異的最重要部位[4-6]。

2017年3月，在廣東大浦地區某黑山羊養殖場發生了一例疑似羊口瘡病毒感染的病例，我們進行了病毒的分離、鑒定和重要免疫原及毒力基因的遺傳演化分析，這為該地區羊口瘡的綜合防控及監測提供了基礎性數據。

1 材料與方法

1.1 病料的采集與處理 2017年3月在廣東大浦某羊場無菌采集疑似發生口瘡病羔羊的唇部增生物備用。對采集的山羊口唇部增生物剪碎、加入4 ℃預冷的無菌PBS研磨成懸液，同時加入雙抗，以5 000 r/min離心10 min，用0.45 μm過濾器過濾上清液凍存于超低溫冰箱，用于后續試驗。

1.2 試驗材料 胎牛血清和細胞培養基MEM，購自Gibco公司；青霉素/鏈霉素(雙抗)磷酸鹽緩沖液(PBS)，購自美國Geneview公司；限制性內切酶EcoR I、LATaqDNA連接酶、pMD18-T載體、總DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒和DNA Marker，均購自TaKaRa公司。

1.3 病毒分離 OFTu細胞由華南農業大學寧章勇教授惠贈，按照文獻的方法[1-2,6]進行培養。取1.2中的病料上清液1 mL接種于生長良好的OFTu細胞，37 ℃吸附1 h，吸附完成后棄上清液更換完全培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2細胞培養箱靜置培養，每天觀察細胞，細胞出現病變效應(CPE)，反復凍融3次，用細胞刮收集細胞，12 000 r/min離心 10 min，將上清1 mL接種到新的細胞中，連續盲傳4代，直到細胞出現明顯CEP，將病毒液凍存于超低溫冰箱。

1.4 病毒DNA提取 按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書，從1.3分離的病毒液中提取病毒DNA，獲得的病毒DNA于-20 ℃保存備用。

1.5 ORFV廣東大浦株ORFV 011基因和ORFV 059基因的擴增與克隆 參考GenBank中登錄的羊口瘡病毒基因組序列(AY386263)，利用Primer 5.0軟件設計引物，所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。引物信息如下，ORFV 011上游引物：5′-ATGTGGCCGTTCTCCTTATC-3′，下游引物：5′-TTAATTTATTGGCTTGCAG-3′；ORFV 059上游引物：5′-ATGGATCCACCCGAAATCAC-3′，下游引物：5′-TCACACGATGGCCGTGACCAG-3′。以總DNA提取試劑盒抽提病毒基因組DNA為模板，進行PCR擴增，采用25 μL的PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL(2.5 mmol/L)，cDNA模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，LATaqDNA聚合酶0.2 μL(5U/μL)，超純水17.3 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸 90 s，35個循環；72 ℃終延伸10 min。反應結束后取6 μL PCR反應液在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測擴增結果，經凝膠成像系統觀察并記錄結果。回收PCR擴增的目的片段，然后分別連接到pMD-18T載體，轉化至JM109感受態細胞中，搖均提質粒，將跑膠鑒定正確的質粒送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序。

1.6 ORFV廣東大浦株ORFV 011基因和ORFV 059基因的遺傳進化分析 針對ORFV 011基因和 ORFV 059基因構建進化樹，選取數據庫里含有全基因序列的不同ORFV分離株的ORFV 011基因和ORFV 059基因序列，這些序列經MEGA 5.0軟件比對處理后用Neighbor-joining法構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 羊的發病情況 發病羊場養殖的是本地黑山羊，共200多只，發病羊為20只左右，發生率約為10%；發病年齡不一，從羔羊到成年羊都有。羔羊發病后由于吸奶困難，極易死亡；成年羊采食困難，消瘦。發病羊都具有類似的臨床表現，在口唇部形成典型增生壞死灶，嚴重者在舌上形成潰瘍和增生灶(見中插彩版圖1)，病羊幾乎不能采食。

圖1 發病羊的口腔、唇及舌部形成的增生壞死灶

2.2 病毒的分離 將采集的病羊痂皮組織按照前面描述的方法接種至OFTu細胞，在盲傳4代后，OFTu細胞出現典型的CPE病變(見中插彩版圖2)，細胞出現腫脹、變圓、聚堆和死亡等現象。盲傳4代后，收取病毒液，將該病毒分離株命名為ORFV-GDDP。

圖2 感染ORFV后OFTu細胞病變

2.3 病毒的PCR鑒定 對具有標志性的ORFV 011基因和ORFV 059基因進行擴增。用設計的特異性引物對提取的病毒基因組DNA進行PCR擴增，PCR產物電泳結果顯示:1，在1 000 bp至1 500 bp之間出現一條大小約為1 137 bp的特異性條帶，符合ORFV 011基因大小；2，出現一條約為1 059 bp的特異性條帶，符合ORFV 059基因大小(圖3)。將擴增的目的條帶分別膠回收、克隆以及測序。結果證明我們分離的病毒是羊口瘡病毒，將其命名為ORFV-GDDP分離株，獲得的序列提交至BenBank數據庫，獲得登錄號分別為：MF034455(ORFV 011)、MF034456(ORFV 059)。

圖3 ORFV 011基因和ORFV 059基因的PCR擴增結果

2.4 病毒基因的進化樹分析 對ORFV 011基因和ORFV 059基因使用MEGA 5.0軟件中Neighbor-joining法構建系統進化樹。分離的病毒為羊口瘡病毒，ORFV 011基因系統進化分析表明，GDDP株與新疆毒株xiangjian2和福建毒株FJ-YX、FZ毒株在同一分支上(圖4)。ORFV 059基因系統進化分析表明，GDDP分離株與福建毒株FJ-SL和DG在同一分支上(圖4)。

3 討論

羊口瘡病毒感染山羊和綿羊后，會造成口、唇、鼻、舌、乳房等部位出現丘疹、膿瘡、潰瘍和結痂[7]，在口腔部位由于壞死、結痂和組織的修復再生多次重復發生，會形成巨大的感染性創傷修復灶，這會嚴重的影響山羊的采食。在本次羊群暴發的羊口瘡中，口腔部位是主要的受害部位。該病毒可在牛、綿羊、山羊的腎細胞以及犢牛和羔羊的睪丸細胞上生長，并形成細胞病變[6-7], 我國早期的研究工作均采取了上述細胞進行病毒的分離和鑒定工作。2013年，汪園園等[8]報道了從120日齡羊胚胎鼻甲上分離的上皮細胞(OFTu)具有增殖ORFV效價高、細胞病變顯著的特點，非常適用于ORFV的體外增殖和致病機制的研究。自此，OFTu細胞開始廣泛用于ORFV的分離和鑒定。在本研究中，我們采用了該細胞進行病毒的分離和鑒定，經過4代盲傳即獲得了純化病毒。經過對ORFV 011基因和059基因的擴增、測序，證明我們分離的病毒確實為羊口瘡病毒。從山羊的臨床表現以及后期的病毒分離、病毒編碼基因的擴增和測序等多方面證明，該病為羊口瘡。

圖4 GDDP株ORFV011基因的進化樹

圖5 GDDP株ORFV059基因的進化樹

經PCR擴增GDDP株ORFV的011基因和059基因，獲得了其全基因序列，序列的進化分析表明，ORFV 011基因系統進化分析表明，GDDP株與新疆毒株xiangjian2和福建毒株FJ-YX、FZ毒株在同一分支上。ORFV 059基因系統進化分析表明，GDDP分離株與福建毒株FJ-SL和DG在同一分支上。由于羊口瘡病毒基因組具有廣泛的容納性所造成的同源或非同源基因重組和非必須基因缺失的特殊性[5-6,9-10]，我們懷疑GDDP株ORFV可能是重組病毒。后期的調查表明，大浦當地有從福建和新疆購買的山羊和綿羊，并且這些羊群也發生了羊口瘡，這也進一步證明了大浦當地流行的ORFV病毒株極有可能是來源于福建和新疆等地的毒株的重組病毒。羊口瘡病毒的這種特性，決定了羊口瘡防控極其困難，因此制定羊口瘡的綜合防控措施時，必須考慮病毒流行毒株的分子特性。鑒于廣東省地處亞熱帶、水量充沛，植物性資源豐富，近年來山羊養殖規模逐漸擴大，羊口瘡造成的危害逐年增加，有必要對廣東省進行ORFV系統的流行病學調查，為該地區羊口瘡的綜合防控提供科學的依據。

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