急性低氧運動中大鼠前額皮質TRPV4通道蛋白的免疫組化研究

黃 興， 朱镕鑫, 霍彩云, 唐玉玲, 韓天雨, 于加倍， 張瑋佳， 胡 揚

(1.北京體育大學運動人體科學學院，北京 海淀 100084 ； 2.首都體育學院運動科學與健康學院，北京 海淀 100191；3.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193 ； 4.北京體育大學中國運動與健康研究院，北京 海淀 100084)

瞬時感受器電位離子通道家族香草素受體亞家族Ⅳ型(Transient Receptor Potential Vanilloid 4，TRPV4)通道對于細胞內鈣離子的調控起重要作用[1-2]。人們發現，TRPV4通道是一種能被因低滲引起的細胞腫脹而激活的離子通道[3-4]，可被溫熱、機械、花生四烯酸及其代謝物等多種刺激所激活[5-6]。在中樞神經系統中，TRPV4通道主要分布于大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等部位[7]。研究前額皮質TRPV4通道在低氧環境中運動時的變化，對于后期深入研究低氧運動中前額皮質神經細胞鈣離子通道的變化情況將奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 本研究以120只體重在280～300 g的Wistar大鼠為研究對象，購自北京維通利華實驗動物中心。動物實驗經過北京體育大學動物福利論理委員會批準，動物分籠飼養，室溫20 ℃～24 ℃，相對濕度40%～60%，每日12 h光照/12 h熄燈，國家標準嚙齒類動物常規詞料喂養，大鼠自由飲水、采食。普通動物房模擬平原常氧狀態，采用模擬低氧發生器在低氧房分別模擬海拔2 500 m(低氧1)和4 500 m低氧(低氧2)狀態。將大鼠隨機分為12組，每組10只，分別是常氧-安靜組(常-安組)、常氧-5級組(常-5級組)、常氧-8級組(常-8級組)、常氧-力竭組(常-竭組)、低氧1-安靜組(低1-安組)、低氧 1-5 級組(低1-5級組)、低氧1-8級組(低1-8級組)、低氧1-力竭組(低1-竭組)、低氧2-安靜組(低2-安組)、低氧2-5級組(低2-5級組)、低氧2-8級組(低2-8級組)、低氧2-力竭組(低 2-竭組)。

1.2 大鼠適應跑臺訓練方案 大鼠適應跑臺訓練5 d，速度為10 m/min，每天15 min。大鼠適應跑臺訓練期結束后間隔1 d，進行遞增負荷運動，并按照圖1所示的流程進行剖檢取材。

圖1 取材流程

1.3 大鼠遞增負荷運動方案 大鼠的遞增負荷運動方案參照Leadro基于Wistar大鼠最大攝氧量測試模型。采用逐級遞增負荷進行測試。坡度不變，10°傾斜角，起始速度5 m/min，最大速度50 m/min。第一級負荷持續時間為4 min，此后每一級負荷持續3 min，直至力竭[8]。

1.4 取材 用3%戊巴比妥鈉(0.25 mL/100 g體重)腹腔注射麻醉。待麻醉好后，腹主動脈取血并迅速取出腦組織，切下部分前額皮質置于4%甲醛中固定。

表1 大鼠遞增負荷運動方案[8]

1.5 石蠟切片和H.E.染色 將固定好的前額部分用梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、石蠟切片，每個大腦連續切片，5張取一張，共取6張。常規蘇木素伊紅染色，奧林帕斯顯微鏡BX43觀察拍照。

1.6 免疫組化染色 (1)石蠟切片經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，下行至蒸餾水；(2)PBS洗3次，每次5 min；(3)3%過氧化氫室溫避光作用20 min；(4)蒸餾水洗，PBS洗3次，每次5 min；(5)5%牛血清白蛋白封閉液室溫作用30 min；(6)倒掉封閉液后，滴加已稀釋好的一抗(兔源TRPV4多克隆抗體1∶200倍稀釋)，4 ℃過夜；(7)PBS洗3次，每次5 min；(8)滴加試劑1(聚合物輔助劑)，37 ℃作用30 min；(9)PBS洗3次，每次5 min；(10)滴加試劑2(辣根過氧化物酶多聚體標記的山羊抗兔IgG)，37 ℃ 作用30 min；(11)PBS洗3次，每次5 min；(12)滴加DAB顯色液，室溫避光作用2～10 min，顯微鏡下控制顯色時間；(13)蒸餾水洗，蘇木素染液作用5 min；(14)蒸餾水洗，1%鹽酸酒精分色10 s，經0.1 mol/L pH值7.4 PBS藍化作用15 min；(15)經梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察。同時設染色對照，即一抗替代為PBS。評級方法：0=沒有陽性細胞；1=1～5個陽性細胞；2=6～10個陽性細胞；3=11～15個陽性細胞；4=16～20個陽性細胞；5=多于20個陽性細胞。

2 結果

2.1 H.E.染色結果 各組腦組織病理變化如中插彩版圖2所示。

圖2 大腦前額皮質HE染色圖(H.E. 40×)

注：黑色箭頭指示水腫，空三角指示淤血，三角形指示嗜神經現象，五角星指示結構疏松、偶見淋巴細胞浸潤。A：常-安組，B：常-5級組，C：常-8級組，D：常-竭組，E：低1-安組，F：低1-5級組，G：低1-8級組，H：低1-竭組，I：低2-安組，J：低2-5級組，K：低2-8級組，L：低2-竭組

常氧組：第5級小鼠腦組織可見水腫，血管與周邊組織間隙增寬；第8級腦組織可見水腫、血管擴張充血；力竭組可見腦膜下靜脈淤血。

低1組(2 500 m組)：第5級可見腦組織小血管擴張充血，第8級可見膠質細胞嗜神經現象，靜脈淤血；力竭組可見腦膜疏松水腫、腦膜下和皮質部靜脈淤血。

低2組(4 500 m組)：安靜組可見小血管擴張充血現象；第5級靜脈淤血，可見膠質細胞嗜神經現象；第8級可見膠質細胞嗜神經現象，腦膜下靜脈淤血；力竭組細胞間組織疏松，神經細胞排列紊亂，腦膜下淤血出血、淋巴細胞浸潤。

2.2 免疫組化結果 如中插彩版圖3和圖4所示，TRPV4陽性信號顯示為棕黃色，主要分布在神經細胞和膠質細胞中。無論在常氧環境還是低氧環境，隨著運動強度的遞增，大鼠大腦前額皮質TRPV4的表達量顯著增高，各環境下5級、8級和力竭組均顯著高于同環境安靜組(P<0.01)。

安靜狀態下，低1-安組TRPV4表達量顯著高于常-安組(P<0.05)，低2-安組與常-安組比具有非常顯著性差異(P<0.01)；5級狀態下，低2～5級組與常-5級組比具有非常顯著性差異(P<0.01)；8級狀態下，低1～8級組與常-8級組比具有顯著性差異(P<0.05)，低2～8級組與常-8組相比具有非常顯著性差異(P<0.01)；力竭狀態下，低1-竭組和低2-竭組與常-竭組比均具有顯著性差異(P<0.05)。

圖3 大腦前額皮質TRPV4蛋白免疫組化染色圖(IHC, 40×)

注：箭頭所示為TRPV4陽性信號。A：常-安組，B：常-5級組，C：常-8級組，D：常-竭組，E：低1-安組，F：低1-5級組，G：低1-8級組，H：低1-竭組，I：低2-安組，J：低2-5級組，K：低2-8級組，L：低2-竭組

圖4 大腦前額皮質TRPV4免疫組化陽性統計結果

3 討論

TRPV4通道最早是于2000年由Liedtke等人提出[9]。人類的TRPV4基因存在于12q23～q24染色體上，表達于第15號外顯子上[10]。目前己確定TRPV4的5種亞型，分別是TRPV4-A～E。細胞內質網中蛋白質儲留、低聚反應缺失和通道失活的現象可由亞型B, C和E在N-末端錨蛋白重復結構域(ANK)的缺失所導致[11-12]。結構上，TRPV4通道蛋白由871個氨基酸組成，氨基端和羧基端均位于胞質側，其具有6個跨膜區(S1-6)，在S5與S6區之間有一個發卡通道結構，形成孔通道環，該孔通道環允許鈣離子等陽離子通過[13-14]。TRPV4通道蛋白約30%體積位于胞膜上，約70%暴露于細胞內或細胞外，該結構特點為其與細胞內外的蛋白相互作用從而調節通道的功能提供了極大便利[15]。起初，人們發現TRPV4通道是一種能被因低滲引起的細胞腫脹而激活的離子通道[3-4]。后續研究表明，TRPV4通道還可被溫熱、機械、花生四烯酸及其代謝物等多種刺激所激活[5-6]。在中樞神經系統中，TRPV4通道主要分布于大腦皮層、海馬、丘腦、小腦等部位[7]。

大腦缺血缺氧時，主要通過以下兩方面激活TRPV4通道：一方面，大腦缺血缺氧造成細胞水腫，因而通過改變細胞膜機械張力激活TRPV4通道；另一方面，大腦缺血缺氧造成能量代謝障礙，產生的大量花生四烯酸(AA)通過其代謝產物5,6-環氧二十碳三烯甘油酸(5,6-EET)等也能激活TRPV4通道[16]。

H.E.染色結果顯示，4 500米海拔高度運動至第5級，靜脈淤血現象明顯，與常氧運動第8級所出現的癥狀相似；4 500米海拔高度第8級，腦膜疏松水腫、腦膜下靜脈淤血，與常氧力竭和2 500 m海拔高度力竭所出現的癥狀相似。隨著海拔高度的升高，低氧刺激可導致大強度運動大鼠前額皮質細胞腫脹、靜脈出血、腦膜下靜脈出血等現象更加明顯，可能是運動疲勞提前的重要原因。

免疫組化結果顯示，常氧環境中隨著運動強度的不斷遞增，TRPV4表達量增高，結合H.E.染色結果，可能由于運動導致大腦缺氧，進而細胞膜張力改變，激活了TRPV4通道。同時，模擬海拔高度的增加，即環境氧濃度的降低，也明顯改變了大鼠前額皮質TRPV4的表達量。即使安靜狀態下，2 500 m海拔高度TRPV4的表達量也會顯著高于常氧，4 500 m海拔高度的TRPV4表達量非常顯著性增高。三組組間同級比較，也均有顯著差異，說明低氧環境可對運動大鼠TRPV4的表達量有顯著影響，為后期深入研究低氧環境下中樞神經細胞膜鈣離子通道變化所致的運動疲勞提前出現奠定了基礎。

4 結論

首先，大鼠急性低氧環境遞增負荷運動較常氧提前出現大腦前額皮質組織病理變化。其次，低氧環境可導致運動大鼠腦前額皮質組織中TRPV4通道蛋白表達量顯著升高。

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