抗豬PD-1單克隆抗體的制備與其生物學特性鑒定

岳 鋒 ， 楊 健 ， 周娟娟 ， 朱艷平 ， 李 鵬 ， 孫國鵬 ， 張艷芳 ， 王選年

(新鄉(xiāng)學院生命科學技術(shù)學院 生物技術(shù)研究中心 ， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

程序性死亡因子-1(Programmed Death-1，PD-1)屬于CD28超家族成員，是50 kDa～55 kDa左右的Ⅰ型跨膜蛋白分子，誘導表達于活化的T 細胞、B 細胞、自然殺傷細胞、單核細胞和樹突狀細胞[1]。PD-1有PD-L1和PD-L2兩個配體。PD-L1廣泛表達于T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞以及多種腫瘤細胞[2]。PD-L2則誘導性表達于樹突狀細胞、巨噬細胞、髓源性肥大細胞和生發(fā)中心B細胞[3]。PD-1/PD-L是重要的免疫負調(diào)節(jié)通路，PD-1所介導的負協(xié)同刺激信號能導致T細胞和B細胞的凋亡和功能耗竭[4]。PD-1/PD-L抑制途徑在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展以及慢性病毒感染中均發(fā)揮了重要作用[5-6]。采用抗體阻斷PD-1/PD-L通路可有效提高抗慢性病毒感染或腫瘤性疾病的免疫力[7-8]。因此,制備抗豬PD-1單克隆抗體具有重要的理論研究和實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 重組豬PD-1胞外區(qū)蛋白由本實驗室純化保存，鼠NS0骨髓瘤細胞由本實驗室凍存；BALB/c小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 抗豬PD-1單抗的制備

1.2.1 免疫和細胞融合 重組豬PD-1胞外區(qū)蛋白與弗氏佐劑乳化即為免疫原。頸背部皮下注射免疫雌性BALB/c小鼠，50 μg/只，首免用弗氏完全佐劑，次免用弗氏不完全佐劑，每次間隔14 d，融合前3 d，加強免疫。融合前1 d制備飼養(yǎng)細胞。用雜交瘤細胞融合技術(shù)融合免疫BALB/c小鼠的脾細胞和NS0細胞，融合好放置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 陽性雜交瘤細胞的篩選和克隆 融合細胞培養(yǎng)10 d吸取少量上清用于篩選；14 d陽性孔半量更換HT培養(yǎng)基，同時對陽性孔細胞轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板擴大培養(yǎng)，準備克隆化，間接ELISA法篩選雜交瘤培養(yǎng)上清液，對篩選的特異性較強的陽性孔轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板中擴大培養(yǎng)克隆化。直至所有克隆孔陽性率為100%時，定雜交瘤細胞株。

1.2.3 腹水的制備和純化 將8周齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟致敏。7 d后腹腔注射5×106的雜交瘤細胞，待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水。IgG類單克隆抗體純化試劑盒純化單抗。

1.3 抗豬PD-1 單抗特異性鑒定 間接ELISA和 Western-Blot檢測單克隆抗體的特異性，酶標儀讀取ELISAOD450值，Western-Blot結(jié)果顯色后拍照記錄。

1.4 單抗生物學特性鑒定

1.4.1 單克隆抗體效價的檢測 雜交瘤細胞上清以2倍倍比梯度稀釋，重組PD-1胞外區(qū)蛋白包板，間接ELISA法檢測雜交瘤上清和腹水效價，未免疫鼠血清為陰性對照，各孔OD450值以P/N>2.1為陽性。

1.4.2 單克隆抗體亞型鑒定 用Ig亞類鑒定試劑盒鑒定上述單克隆抗體的Ig亞類，操作步驟嚴格按說明書進行。

1.4.3 雜交瘤細胞株分泌單抗的穩(wěn)定性鑒定 分別收集體外連續(xù)傳代的雜交瘤細胞株上清，用間接ELISA法測定其效價，并凍存細胞，1個月后復蘇凍存的細胞，檢測其培養(yǎng)上清液中的抗體效價，檢測3次，每次間隔1個月，評價雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.4.4 單抗與豬外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)上PD-1蛋白的結(jié)合 前腔靜脈采集豬抗凝血5 mL，密度梯度離心法分離PBMC細胞， 取106個PBMC加入終濃度10 μg/mL抗PD-1的單克隆抗體，鼠IgG1為同型抗體對照，37 ℃作用1 h，用PBS洗滌3次，加入FITC標記的羊抗鼠IgG(1∶500倍稀釋)，37 ℃避光作用 1 h，用PBS洗滌3次，PBS懸浮細胞，流式細胞術(shù)檢測。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清效價 首免后3只小鼠的血清抗體效價分別為3.2×103、3.2×103和6.4×103；三免后分別為2.56×104、2.56×104和5.12×104。

2.2 單抗特異性鑒定

2.2.1 間接ELISA 鑒定 經(jīng)3次亞克隆，獲得1 株分泌特異性單抗的雜交瘤細胞，雜交瘤細胞株命名為2B5，分泌單抗為swPD1-2B5。該單抗能與重組豬PD-1胞外區(qū)蛋白反應，不與雞PD-1、Rosetta上清和pET-32a空載體蛋白反應，說明單抗具有良好的特異性。

2.2.2 Western-Blot 鑒定 Western-Blot 檢測結(jié)果見圖1，單抗swPD1-2B5與豬PD-1胞外區(qū)蛋白(分子量為33 kDa)發(fā)生特異性反應條帶，但不與對照組Rosetta上清與pET-32a(+)空載體蛋白反應。

圖1 Western-Blot鑒定結(jié)果

M: 蛋白Marker； 1： 豬PD-1胞外區(qū)蛋白； 2： Rosetta上清，3： pET-32a(+)空載體蛋白

2.3 單抗生物學特性鑒定

2.3.1 單克隆抗體效價的檢測 雜交瘤細胞上清的效價為1∶212(2B5)；腹水的效價為1∶2.048×105(2B5)。

2.3.2 單抗Ig亞類及穩(wěn)定性鑒定 單抗swPD1-2B5亞型為IgG1。連續(xù)3個月復蘇雜交瘤細胞，間接ELISA檢測上清效價均達到1∶1×212以上。

2.3.3 單抗與豬PBMC上PD-1蛋白的結(jié)合情況 豬PBMC細胞膜上表達PD-1蛋白，用豬PBMC細胞為試驗材料，檢測單抗與PD-1天然蛋白的結(jié)合，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，單抗的熒光強度比同型抗體對照的熒光強度明顯增強(見圖2)，表明單抗swPD1-2B5可以與豬PBMC上的PD-1蛋白結(jié)合。

圖2 單抗與豬PBMC上PD-1 的結(jié)合

3 討論

PD-1/PD-L信號通路對獲得性免疫應答起負調(diào)控作用，該種調(diào)控對機體自身而言是為了避免過度免疫應答對機體組織的損傷，是一種自我保護機制，但在病毒慢性持續(xù)性感染過程中，PD-1/PD-L通路活化導致機體免疫功能損傷[3-4]。本實驗室前期研究表明，豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型感染，可以引起豬PD-1/PD-L通路活化，是導致機體免疫功能損傷的致病機制之一[9-10]，抗PD-1或PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L通路可以恢復機體的免疫功能，在相關(guān)性疾病治療中具有重要意義[4-7]。因此，制備抗豬PD-1單抗對檢測PD-1/PD-L通路活化和阻斷PD-1/PD-L具有重要的理論和應用價值。

本試驗運用常規(guī)的ELISA抗體篩選方法，以誘導表達純化的豬PD-1胞外區(qū)蛋白為免疫原，免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生針對靶分子的特異性免疫應答。運用ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，篩選出陽性上清液的生長孔內(nèi)常會出現(xiàn)兩個以上的雜交瘤細胞克隆，有的克隆細胞分泌的不是目標抗體，有的可能不分泌抗體，因此，要利用克隆培養(yǎng)方法將陽性雜交瘤細胞篩選出來。最常用的雜交瘤克隆培養(yǎng)法是有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法。檢測該單抗與豬天然PD-1蛋白結(jié)合與否對其應用價值至關(guān)重要，由于PD-1蛋白主要表達在活化的T細胞、B細胞、NK細胞、NKT 細胞、單核細胞和樹突狀細胞[1]，因此可以用豬PBMC細胞來檢測該單抗與豬天然PD-1蛋白的結(jié)合，流式細胞術(shù)結(jié)果表明，篩選單抗可以與豬PBMC上的PD-1蛋白有效結(jié)合。因此本研究獲得的單抗swPD1-2B5對研究豬體內(nèi)某些組織細胞上PD-1的表達水平變化與疾病的進程關(guān)系具有重要理論意義和應用價值。

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