3種口蹄疫O型抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)疫苗免疫牛血清抗體檢測(cè)的比較試驗(yàn)

董春娜， 馬愛榮,2， 張 蕾， 李 靜， 巴利民， 王振豹， 齊 鵬， 汪 明， 肖 進(jìn)

(1. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)中心，北京 海淀 100095 ； 2. 中牧股份蘭州生物藥廠，甘肅 蘭州 730046 ； 3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起偶蹄動(dòng)物的烈性傳染病，該病傳播途徑多、傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展及畜產(chǎn)品生產(chǎn)供應(yīng)，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)在1984年將其列為A類傳染病之首[1]。我國(guó)每年都投入大量人力、物力和財(cái)力用于口蹄疫的防控，疫苗的免疫效果直接影響著口蹄疫防控的成敗，因此加強(qiáng)針對(duì)口蹄疫疫苗免疫后動(dòng)物的免疫抗體水平的監(jiān)控，才能確保疫苗的免疫效果，從而做好口蹄疫的防控[2]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)在口蹄疫抗體檢測(cè)中因其具有敏感、特異、穩(wěn)定、快速等特點(diǎn)而備受青睞，為了進(jìn)一步了解不同檢測(cè)方法的相關(guān)性和特點(diǎn)，同時(shí)為了對(duì)本實(shí)驗(yàn)室研制的基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)，本試驗(yàn)選取了國(guó)際上廣泛使用的基于單克隆抗體的進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒(Prionics-O)，當(dāng)前國(guó)內(nèi)廣泛使用的基于多克隆抗體的液相阻斷ELISA試劑盒(LB-O)和本實(shí)驗(yàn)室研制的基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒(iELISA-O)3種試劑盒進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，對(duì)3種試劑盒的符合程度、重復(fù)性和便捷性進(jìn)行比較，以期選擇更簡(jiǎn)單、更準(zhǔn)確的方法用于大規(guī)模檢測(cè)，從而做好口蹄疫防控工作。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 口蹄疫病毒O型抗體檢測(cè)阻斷ELISA試劑盒(Prionics-O) 由瑞士Prionics公司生產(chǎn)，批號(hào)為：O160501L。

1.1.2 口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒(LB-O) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所研制生產(chǎn)，批號(hào)為：20170221101-1。

1.1.3 自制間接ELISA試劑盒(iELISA-O) 基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒，批號(hào)為2016001。

1.1.4 被檢血清 從臨床送檢血清中選擇免疫口蹄疫O型滅活疫苗后第14天、21天和第28天血清各50份，共150份血清。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)結(jié)果一致性的比較 對(duì)150份血清樣品分別使用Prionics-O、LB-O和iELISA-O 3種試劑盒同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，分別按其說明書進(jìn)行操作(LB-O操作中，根據(jù)其說明書，血清進(jìn)行1∶128倍稀釋來判定陰陽(yáng)性)，最后以3種試劑盒各自判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，對(duì)各試劑盒檢測(cè)的抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分別用Kappa統(tǒng)計(jì)方法比較其一致性。Kappa值計(jì)算方法按照文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行，Kappa值越高代表一致性越好。Kappa值<0.40，表明兩種方法間一致性較差；Kappa值在0.41～0.60，中度符合；Kappa值在0.61～0.80，高度符合；Kappa值在0.81～1.00，完全符合。

1.2.2 重復(fù)性比較 從150份血清樣品中隨機(jī)抽取15份血清，應(yīng)用同一批試劑盒，分2次檢測(cè)，比較2次檢測(cè)結(jié)果，對(duì)各試劑盒的重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.3 結(jié)果判定

1.2.3.1 Prionics-O結(jié)果判定PI值<50%，判為陰；PI值≥50%，判為陽(yáng)性。PI值=100-(待檢樣品OD450nm值/陰性對(duì)照OD450nm值×100)。

1.2.3.2 LB-O結(jié)果判定 以病毒抗原對(duì)照OD450nm值的50%為臨界值，被檢血清稀釋孔OD450nm值大于臨界值為陰性，小于或等于臨界值為陽(yáng)性，抗體滴度≥1∶128判定陽(yáng)性。

1.2.3.3 iELISA-O結(jié)果判定 臨界值(Cut-off值)=陽(yáng)性對(duì)照孔OD450nm均值×0.17；待檢血清測(cè)定OD450nm值≥臨界值者判為陽(yáng)性；待檢血清測(cè)定OD450nm值<臨界值者判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性的比較 用Kappa值對(duì)3種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，兩兩試劑盒之間進(jìn)行一致性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Prionics-O與LB-O的Kappa值為0.86，表明Prionics-O與LB-O完全符合(表1)；Prionics-O與iELISA-O的Kappa值為0.89，表明Prionics-O與iELISA-O完全符合(表2)；LB-O與iELISA-O的Kappa值為0.84，表明LB-O與iELISA-O完全符合(表3)。

表1 Prionics-O試劑盒與LB-O試劑盒一致性分析

注：Kappa值=0.86

表2Prionics-O試劑盒與iELISA-O試劑盒一致性分析

iELISA-OPrionics-O+-合計(jì)+1330133-31417合計(jì)13614150

注：Kappa值=0.89

表3 LB-O試劑盒與iELISA-O試劑盒一致性分析

注：Kappa值=0.84

2.2 3種試劑盒在不同時(shí)間對(duì)免疫血清的檢出率 檢測(cè)結(jié)果顯示(表4)，3種試劑盒檢測(cè)血清中的抗體陽(yáng)性率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)不斷升高的趨勢(shì)，雖然3種試劑盒均可在免疫后第28天100%檢測(cè)到牛血清中的口蹄疫O型抗體，但疫苗免疫后第14天，Prionics-O和iELISA-O均可檢測(cè)到36/50牛血清中口蹄疫O型抗體陽(yáng)性，LB-O可檢測(cè)到35/50牛血清中口蹄疫O型抗體陽(yáng)性；免疫后第21天，Prionics-O試劑盒100%檢測(cè)到牛血清中的口蹄疫O型抗體，LB-O和iELISA-O分別可檢測(cè)到47/50和49/50牛血清中口蹄疫O型抗體陽(yáng)性。因此，Prionics-O試劑盒檢測(cè)敏感性稍高于國(guó)產(chǎn)的兩種試劑盒。

表4 3種試劑盒在不同時(shí)間對(duì)免疫牛血清陽(yáng)性檢出統(tǒng)計(jì)

注：分子為檢測(cè)陽(yáng)性血清份數(shù)，分母為檢測(cè)血清份數(shù)

2.3 3種試劑盒重復(fù)性比較 檢測(cè)結(jié)果如表5所示，3種試劑盒前后兩次檢測(cè)結(jié)果雖然PI值/OD值略有不同，但是結(jié)果判定完全一致，因此，國(guó)內(nèi)廣泛使用的口蹄疫O型液相阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和本實(shí)驗(yàn)室研制的基于合成肽包被抗原的間接ELISA試劑盒與國(guó)際上廣泛使用的瑞士Prionics公司生產(chǎn)的口蹄疫病毒O型抗體檢測(cè)阻斷ELISA試劑盒一樣，具有良好的重復(fù)性。

表5 重復(fù)性比較試驗(yàn)

注：N表示結(jié)果判定為陰性，P表示結(jié)果判定為陽(yáng)性。Test1和test2分別表示第1次檢測(cè)和第2次檢測(cè)

2.4 3種試劑盒便捷性比較 應(yīng)用Prionics-O試劑盒檢測(cè)一批樣品耗時(shí)大約3～4 h、應(yīng)用iELISA-O試劑盒檢測(cè)一批樣品耗時(shí)大約1.5～2 h，且這兩種試劑盒操作也較為簡(jiǎn)單，而應(yīng)用LB-O試劑盒進(jìn)行檢測(cè)需要1天1夜才能出結(jié)果，從操作便捷性來說，iELISA-O試劑盒最優(yōu)，Prionics-O試劑盒其次，LB-O試劑盒不僅操作麻煩，而且耗時(shí)較長(zhǎng)。

3 討論

通過進(jìn)口阻斷ELISA試劑盒，國(guó)產(chǎn)液相阻斷ELISA試劑盒和間接ELISA試劑盒3種試劑盒對(duì)150份免疫血清的檢測(cè)結(jié)果可知，3種試劑盒檢測(cè)結(jié)果之間具有較高的符合性，本實(shí)驗(yàn)室研制的試劑盒與進(jìn)口試劑盒的符合程度稍高。總體而言，進(jìn)口試劑盒的敏感性高于其他兩種試劑盒，這可能是由于進(jìn)口試劑盒是基于單克隆抗體研制的試劑盒，單克隆抗體針對(duì)的表位是口蹄疫O型上較為保守位點(diǎn)，因此受病毒毒株變異的影響較小，因此陽(yáng)性檢出率會(huì)更高，而液相阻斷ELISA由于其用于中和血清抗體的是全病毒抗原，受口蹄疫毒株變異的影響較大，如果動(dòng)物免疫的毒株與試劑盒病毒抗原不匹配就會(huì)影響其檢測(cè)的敏感性。本實(shí)驗(yàn)室研制的試劑盒，為了克服口蹄疫毒株變異對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，在抗原設(shè)計(jì)方面盡可能涵蓋了目前國(guó)內(nèi)主要流行的毒株和疫苗中使用的毒株，因此檢測(cè)的敏感性有一定的提升，但敏感性還是稍低于進(jìn)口試劑盒。

重復(fù)性結(jié)果顯示，3種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性都較好，因此可以說這3種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果均是可靠的，可應(yīng)用于口蹄疫疫苗免疫后的抗體水平的檢測(cè)。從價(jià)格上來說，進(jìn)口試劑盒價(jià)格相較于國(guó)產(chǎn)試劑盒為昂貴，僅適合于實(shí)驗(yàn)室研究和一些實(shí)力較為雄厚的養(yǎng)殖場(chǎng)使用，國(guó)產(chǎn)試劑盒在價(jià)格上優(yōu)勢(shì)較為明顯。從操作便捷性來說，本實(shí)驗(yàn)室研制試劑盒顯著優(yōu)于其他兩種商品化試劑盒，不僅操作簡(jiǎn)單，而且耗時(shí)較短。

[1] 普拉. 口蹄疫流行病學(xué)及其防制[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2011, 32(9): 44-45.

[2] 何繼軍, 郭建宏, 劉湘濤. 我國(guó)近年口蹄疫流行形勢(shì)與主要流行毒株概況[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫, 2015，32(6):10-14.

[3] 夏邦世, 吳金華. Kappa一致性檢驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2006,29(1):83-84.