石河子地區(qū)主要豬場豬流行性腹瀉流行情況及防控調(diào)查

黃 新 ， 韓猛立 ， 張星星 ， 吳桐忠 ， 何延華 ， 鐘發(fā)剛

(新疆生產(chǎn)建設兵團動物疾病防控重點實驗室 新疆農(nóng)墾科學院 ， 新疆 石河子 832000)

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳播性的腸道疾病。該病以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水為主要特征。各年齡豬均易感，尤其是哺育仔豬，發(fā)病率為100%，死亡率為80%～100%。2010年來，該病在我國大部分地區(qū)均有流行[1]。2013-2015年期間，石河子市及周邊地區(qū)多個豬場出現(xiàn)2周齡內(nèi)仔豬腹瀉死亡的群發(fā)病例。為了弄清發(fā)病病原及流行情況，我們采集了該地區(qū)有腹瀉流行部分豬場的糞便樣本，進行RT-PCR檢測，調(diào)查該地區(qū)PED的流行及防控情況，為該疫病的診斷和預防提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2013年5月-2015年12月樣品采集于石河子地區(qū)的莫索灣、安集海、下野地墾區(qū)和石河子市周邊，樣品來自該區(qū)域29個流行仔豬腹瀉豬場的487份肛拭子，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｘi群主要來自1～15日齡的新生仔豬，有臨床癥狀的樣本的豬主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉。

1.2 試劑與材料 RNA提取試劑盒，購自Invitrogen公司的TRIZol；反轉(zhuǎn)錄(AMV)試劑盒、TaqDNA 聚合酶(含10×Buffer)、dNTP，DL-2 000 bp DNA Marker、膠回收試劑盒、pMD18-T連接試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，基因組提取試劑盒為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品，DH5α由本實驗室保存。

1.3 擴增豬病毒性腹瀉的引物設計及合成 根據(jù)GenBank PEDV M蛋白相對保守序列設計3條引物，F(xiàn)m1:5′- GGGCGCCTGTATAGAGTTTA-3′; Rm1:5′- TGGAATGCAGACCTGTCG-3′; Rm2: 5′- AGACCACCAAGAATGTGTCC-3′;由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 樣本的處理及病毒總RNA的提取 使用PBS將肛拭子腸內(nèi)容物制成10%懸液，混勻，3 000 r/min(4 ℃)離心10 min。取上清400 μL，使用TRIZol法提取樣品中的總RNA。

1.5 RT-PCR擴增 PEDV特異性片段及克隆測序 首先以反轉(zhuǎn)錄引物Rm1進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，反應采用10 μL體系：模板RNA 5.5 μL，20 μmol/L引物Rm1 0.5 μL，70 ℃保溫10 min后，在冰上速冷2 min，加入5×M-MLV Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.25 μL,200 U/μL RTase M-MLV 0.25 μL, DEPC水補至10 μL，瞬時離心后42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min，4 ℃存放備用。以此為模板，使用引物Fm1/Rm1進行PCR第1次擴增，然后使用一擴產(chǎn)物1 μL分別使用引物Fm1/Rm2進行第2次擴增。PCR反應條件如下：94 ℃變性5 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s 30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。兩次的反應條件相同。反應結束取第2次擴增的PCR產(chǎn)物 5 μL，用15 g/L的瓊脂糖電泳檢測擴增結果。

1.6 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病初次和再次流行特征調(diào)查 使用調(diào)查問卷及定期回訪的形式對石河子部分地區(qū)發(fā)病豬場豬流行性腹瀉持續(xù)追蹤和現(xiàn)場調(diào)研。

2 結果

2.1 發(fā)病的流行特點及臨床癥狀 發(fā)病豬場1～3日齡新生仔豬出現(xiàn)腹瀉，3～5日齡死亡率最高，能耐過15日齡的仔豬逐漸癥狀減輕，但往往生長不良；部分生產(chǎn)母豬厭食、發(fā)熱和嘔吐，其他豬群偶有腹瀉，1周即康復。發(fā)病仔豬主要繼發(fā)性水樣腹瀉，黃色或灰白色，惡臭同時伴有體溫升高，后消瘦，被毛粗亂、精神委靡不食、全身衰竭，使用抗生素等藥物無效。

2.2 目的片段RT-PCR的擴增結果 以腸內(nèi)容物提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后使用引物Fm1/Rm1一擴，用其產(chǎn)物分別使用Fm1/Rm2 (圖1)，獲得預期大小(412 bp)PEDV特異性片段，與預期結果一致，見圖1。后克隆測序，為預計目的基因序列。

圖1 樣本中PEDV PCR的擴增

M: DNA分子質(zhì)量標準; 1-7: Fm1/Rm2二擴結果

2.3 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病病原調(diào)查情況 將采集的石河子部分地區(qū)及周邊29個豬場487份樣品RT-PCR結果進行分析，結果顯示，該地區(qū)豬流行性腹瀉病原感染陽性率從30.0%～87.5%。其中石河子市周邊的145團陽性率最高，達到了87.5%，豬場平均陽性率為75.9%(22/29)，見表1。

2.4 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病初次和再次流行特征分析

2.4.1 發(fā)病地區(qū)初次流行特征 對發(fā)病豬場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四季都有發(fā)病，沒有明顯的季節(jié)性特點。但距離相近的豬場發(fā)病時間間隔較短，按時間來看，首先是石河子周邊的石河子總場、沙灣先發(fā)病，其次是莫索灣148團、149團發(fā)病，最后是下野地和安集海地區(qū)見表1。

表1 石河子地區(qū)豬流行性腹瀉病原檢測結果

2.4.2 發(fā)病地區(qū)再次流行特征 對發(fā)病地區(qū)持續(xù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有15個豬場(其他13個豬場數(shù)據(jù)不詳)在初次流行該病時，發(fā)病率達50%～95%，經(jīng)過8～12個月后，新生仔豬腹瀉的發(fā)病率下降到15%～20%。但死亡率多在90%以上，表現(xiàn)在某窩或某幾窩仔豬全部死亡；發(fā)病豬妊娠時同圈母豬產(chǎn)仔正常，與發(fā)病仔豬鄰窩豬群也生長正常。發(fā)病母豬表現(xiàn)產(chǎn)后厭食、高熱和嘔吐等癥狀，3～6 d恢復正常，其仔豬常常消瘦脫水而死亡。

2.5 石河子部分地區(qū)豬流行性腹瀉病流行豬場采取的防控策略及效果

2.5.1 流行前后采取的防控策略 通過對石河子市及周邊地區(qū)29個豬場的防疫情況及流行發(fā)病后所采取的防控出來方案進行調(diào)查，豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗已經(jīng)作為日常免疫程序的豬場23個，按照4個月1次對母豬進行普免；2個豬場在腹瀉流行期前2個月免疫過該滅活苗；沒有接種該疫苗的豬場有3個。

流行該病后，16個豬場對全群母豬緊急接種了豬豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗，其中2個豬場在發(fā)病后，連續(xù)3個月緊急接種該滅活疫苗，1次/月；5個豬場采取給產(chǎn)前母豬喂食腹瀉仔豬排泄物；另外5個豬場沒有采取注射疫苗的手段，僅僅使用每天及時清除腹瀉物、消毒及抗生素等策略。

2.5.2 防控效果 不論是流行前還是流行后采取以上一種或多種防控方案的豬場，都沒有取得有效控制該病的結果。

3 討論

本工作中調(diào)查了石河子莫索灣、安集海、下野地和石河子市周邊地區(qū)29個有腹瀉癥狀的豬場，檢測豬流行性腹瀉病毒流行和防控情況，為該病的確診及進一步防控提供了依據(jù)。檢測發(fā)現(xiàn)487份肛拭子樣品中，304份樣品陽性，平均陽性率62.4%，不同地區(qū)的陽性率差異較大(30.0%～87.5%)。29個豬場中22個豬場豬流行性腹瀉病毒陽性，平均陽性率75.9%。可以確認豬流行性腹瀉病毒是引起新生仔豬群腹瀉疫情的主要病原。在檢測PEDV病原時，從部分豬場的臟器中也分離到了致病性大腸桿菌，可能加重了一些豬場仔豬腹瀉和死亡。

免疫疫苗本是防控該病的主要手段，但是本調(diào)查中75.9%(22/29)的豬場在此疫情之前都已經(jīng)免疫豬流行性腹瀉疫苗，所有的豬場都緊急接種了該疫苗，同時2個豬場連續(xù)3個月對豬場母豬普免疫苗，但都沒有取得明顯的效果。內(nèi)地多個地區(qū)的免疫豬場都沒有逃脫該病的流行[2-3]。資料表明，多地流行株與疫苗毒株CV777遺傳關系較遠，可能是該病流行的主要原因[4-5]。

[1] 常鐵城,陳建飛,馮力，等.2014年部分地區(qū)豬流行性腹瀉病毒流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2016,38(4):335-338.

[2] 趙振鵬,楊振,林偉東,等.江蘇省豬流行性腹瀉病毒的流行病學調(diào)查[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2015,43(19):125-127.

[3] 董彥鵬,白娟,范寶超,等．豬流行性腹瀉病毒RT-PCR檢測與ORF3基因分子流行病學調(diào)查[J].中國預防獸醫(yī)學報,2013,35(7):555-558.

[4] 劉孝珍,陳建飛,時洪艷,等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國預防獸醫(yī)學報,2012,34(3):180-183.

[5] 施標,董世娟,朱于敏,等.中國豬流行性腹瀉病毒分子流行病學研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)科學, 2013,46(20):4 362-4 369.