吉西他濱納米磁靶向藥囊對肺癌相關蛋白P53表達的影響

薛克營 柯明耀 吳雪梅 趙年貴 林巖 沈杰芳

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·論 著·

吉西他濱納米磁靶向藥囊對肺癌相關蛋白P53表達的影響

薛克營 柯明耀 吳雪梅 趙年貴 林巖 沈杰芳

目的 觀察吉西他濱納米磁靶向藥囊對肺鱗癌細胞株A2裸鼠移植瘤模型的抑瘤率、血常規、肝腎功能和P53的表達變化探討其療效、安全性和抑制肺癌的機制。方法 將植入肺鱗癌細胞株A2的肺癌裸鼠模型分為5組NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組、NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組和未干預組。觀察各組腫瘤抑制率、血常規和肝腎功能,采用RT-PCR和western blot方法檢測各組在藥物干預后P53的表達情況。結果 NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組腫瘤抑制最明顯，骨髓抑制和肝功能損傷最輕；NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組P53水平與未干預組相比顯著降低(P<0.01)；NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組的P53與未干預組相比有差異性(P<0.05)；三者之間沒有統計學差異。結論 吉西他濱納米磁靶向藥囊抑瘤作用明顯，毒副作用輕，可能通過下調P53表達而發揮抑制肺癌的作用。

納米磁靶向藥囊; 吉西他濱; 肺癌；P53

抗腫瘤納米藥物可將化療藥物靶向性帶入目標部位進而發揮抗腫瘤作用[1-3]。在外部磁場作用下，納米磁小體藥物聚集于靶組織從而提高藥物的靶向性。磁化的NiTi合金支氣管支架具有較好的磁性，可通過纖支鏡植入到肺癌病灶處，再給患者應用納米磁小體靶向藥囊，則納米磁小體靶向藥囊就可以附著在支架上，實施靶向局部給藥，達到降低藥物副作用、提高療效的目的。P53蛋白與人類腫瘤的發生密切相關，本研究通過檢測不同處理后肺鱗癌細胞株A2移植瘤模型的腫瘤抑制率、血常規、肝腎功能和P53的表達變化,探討其療效、安全性和抑制肺癌的機制。

資料與方法

一、實驗動物與細胞株

SPF級裸小鼠50只，6周齡、雄性，體質量18g-20g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬) 2015-0006；人肺鱗癌A2細胞株購自中國科學院細胞庫。

二、藥物與試劑

吉西他濱(江蘇豪森藥業公司)、NiTi合金支氣管支架(南京微創)、RMPI-1640(GIBCO, USA)、優級胎牛血清(GIBCO,USA)、TRIZOL試劑(Invitrogen)等, P53及β-actin引物由華大基因合成。

三、細胞培養

將人肺鱗癌A2細胞株接種于含10%胎牛血清RMPI-1640培養基中于37℃，5% CO2細胞培養箱中培養。

四、肺癌裸鼠模型的建立

將培養好的A2細胞用PBS稀釋至濃度為1×107個/mL。取0.2mL上述細胞懸液接種于裸鼠右股外側皮下。移植后20d(挑選腫瘤體積均約在72.5mm3左右的裸鼠)作為肺癌實驗動物模型。

五、實驗分組

將50只裸鼠肺癌模型平均分成NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組、NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組和未干預組，手術植入NiTi合金支氣管支架于腫瘤中，通過尾靜脈單次注入納米磁靶向藥囊或化療藥物。其中吉西他濱有效劑量均按45 mg/kg 給予，正常對照組尾靜脈注射同量的生理鹽水處理，連續給藥10天。

六、腫瘤抑制和毒副作用觀察

裸鼠自接種后每天觀察荷瘤鼠存活和精神狀況，以游標卡尺測量腫瘤最長徑(a) 和最短徑(b)，計算腫瘤體積(V)，V=0.52×a×b2, 繪制腫瘤生長曲線。給藥第11天脫頸處死小鼠，分離移植瘤并計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組-治療組)/對照組×100%；采集小鼠的血液，行血常規和肝腎功能檢測。

七、RT-PCR檢測P53表達

給藥第11天脫頸處死小鼠，取各組小鼠的腫瘤組織按照trizol法提取組織總RNA后，通過酶標儀測定其260nm和280nm的OD值計算RNA的濃度。取總RNA進行逆轉錄反應生成cDNA，然后進行RT-PCR擴增。β-actin上游引物:5′-GCTCGTCG TCGACAACGGCTG-3′,下游引物: 5′-CAAACATG ATCTGGGTCATCTTTTC-3′；p53上游引物：5′-CACGTACTCTCCTCCCCTCAATA-3，下游引物：5′-TCTTCCAGTGTGATGATGGTAAGG-3′。反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，36個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃ 5min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，使用凝膠圖像分析軟件測定目的條帶和β-actin的灰度值，以兩者的比值表示RT-PCR目的產物的相對表達量。 Western blot檢測P53表達。

八、 統計學方法

結 果

一、腫瘤抑制和毒副作用觀察結果

各給藥組小鼠狀態良好，注射局部正常。由腫瘤生長曲線和抑瘤率可見各處理組的腫瘤生長均受到不同程度抑制，以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組生長最為緩慢，腫瘤抑制最為明顯，化療藥物組、納米磁靶向藥囊組和NiTi合金支氣管支架+化療藥物組相當(見圖1、表1)。

圖1 不同藥物處理對小鼠腫瘤生長的影響表1 不同藥物處理對小鼠腫瘤生長的影響±s)

組別n/只腫瘤體積/cm3瘤重/g抑瘤率/%未干預組109.05±1.81 1.41±0.67 -化療藥物104.35±0.98*1.02±0.18Δ28◇納米磁藥囊103.88±1.04**0.88±0.63ΔΔ38◇◇Niti支架+化療藥物104.01±1.79***0.94±0.36ΔΔΔ33◇◇◇Niti支架+納米磁藥囊102.04±0.28****0.58±0.20ΔΔΔΔ59◇◇◇◇

與未干預組相比，*P、ΔP、◇P<0.05，**P、ΔΔP、◇◇P<0.05，***P、ΔΔΔP、◇◇◇P<0.05，◇◇◇P、ΔΔΔΔP、◇◇◇◇P<0.05；與NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組相比，*P、ΔP、◇P<0.05，**P、ΔΔP、◇◇P<0.05，***P、ΔΔΔP、◇◇◇P<0.05

治療10d后，與未干預組相比，各治療組小鼠白細胞、血小板均顯著降低(P<0.05)，但以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組降低最少，差異具有統計學意義(P<0.05)；紅細胞、血紅蛋白5組間無明顯差異，P>0.05，(見表2)。與未干預組相比，各治療組小鼠丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)含量升高(P<0.05)，但以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組升高最少，差異具有統計學意義(P<0.05)；尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總蛋白(TP)和白蛋白(ALB)差異不顯著，P>0.05，(見表3)。

表2 治療后血常規比較

與未干預組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05，****P、ΔΔΔΔP<0.05；與NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05

表3 治療后肝腎功能比較

與未干預組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05，****P、ΔΔΔΔP<0.05；與NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組相比，*P、ΔP<0.05，**P、ΔΔP<0.05，***P、ΔΔΔP<0.05

二、RT-PCR檢測P53 mRNA表達的變化

NiTi合金支氣管支架+化療藥物組、納米磁靶向藥囊組、化療藥物組三組間表達無明顯差異，與未干預組比較明顯減弱(P<0.05), NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組較未干預組表達下降極顯著P<0.01。(見圖2)。

三、Western blotting檢測P53蛋白表達

與未干預組相比，化學藥物組、納米磁靶向藥囊組和NiTi合金支氣管支架+化療藥物組明顯降低(P<0.05)，NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組極顯著下降，P<0.01。(見圖3)。

討 論

吉西他濱是一種抗腫瘤藥物,在人和小鼠體內可以抑制核苷酸還原酶的合成,導致細胞內脫氧核苷三磷酸酯減少,其主要作用于細胞增殖中G1/S期,進而抑制細胞增殖，并對小鼠多種腫瘤有效。在吉西他濱作用于非小細胞肺癌細胞系 NH460 和NH322 的研究中,Tohis 等[4]發現吉西他濱引起具有 Wt-p53 的NH460 細胞P53 的表達,當吉西他濱使用劑量很低時,其依賴于P53的作用,而使腫瘤細胞聚集在G1期,當使用劑量很高時,其會引起P53 介導的細胞凋亡機制。

圖2 各治療組治療10d后P53 mRNA表達結果

A：NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組;B：NiTi合金支氣管支架+化療藥物組；C：納米磁靶向藥囊組；D：化療藥物組；E：未干預組。*P<0.05；***P<0.01。

圖3 各治療組治療10d后P53蛋白表達結果

A：未干預組(B: 化療藥物組；C: 納米磁靶向藥囊組；D：NiTi合金支氣管支架+化療藥物組；E：NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組。*P<0.05；***P<0.01

納米靶向藥物載體是靶向治療腫瘤的有效載體形式,主要是借助于磁場效應使藥物聚集在靶位點。不僅可以有效提高治療效果,還可以減少藥物的毒副作用。納米磁靶向藥物是由磁場、高分子骨架材料和化療藥物組成。Lubbe等[5]利用Fe2O3作為磁場,表面覆蓋多聚淀粉制成磁性納米小粒,通過靜脈注射,再結合外磁場的作用,可以靶向治療小鼠腫瘤。2000年,Alexion等[6]利用磁性納米粒靶向治療后肋中部植入VX2鱗狀上皮癌的新西蘭大白鼠,經過靶向治療35d后,26只上皮癌模型小鼠的腫瘤完全消失,且完全沒有副作用。2003年,他們進一步利用放射性同位素標記磁性納米粒,探究納米粒藥物在體內的分布情況。隨后他們又從細胞水平證明磁性納米粒在腫瘤治療中發揮重要作用。其結果發現經磁性納米粒靶向治療后的腫瘤組織中藥物的濃度遠遠高于普通化療藥物濃度[7]。

多種化療藥物主要通過調控腫瘤細胞的凋亡進而起到對腫瘤細胞的殺傷作用。腫瘤抑制因子p53在不同的刺激下分別調節細胞周期或者細胞凋亡。它不但可以通過轉錄活化許多靶基因如P21、Bax、p53DINP1、Puma等，而且還可以通過轉錄非依賴的形式來調節細胞凋亡。P53在許多惡性腫瘤中高表達，降低腫瘤組織中P53的表達對腫瘤治療有著重要意義。

因研究動物限制，部分檢測無法自身前后對比，因此多對照未干預組統計。本研究通過制備肺癌裸鼠模型進行不同方式的化療藥物治療，結果發現通過腫瘤內植入磁場結合納米磁靶向藥物的方式可以顯著降低P53蛋白的表達，說明納米磁靶向藥囊可以更大程度抑制組織局部腫瘤P53蛋白的表達，抑制腫瘤的生長。研究結果也顯示，在各給藥組小鼠狀態均良好，局部尾靜脈注射也正常的情況下，以NiTi合金支氣管支架+納米磁靶向藥囊組腫瘤生長最為緩慢，對骨髓抑制和肝功能的損傷程度最輕，說明該治療方法療效高，毒副作用輕，為進一步將內置磁場結合納米磁靶向藥物抑制人中央型肺癌的生長奠定了很好的基礎。

目前,國內外磁性納米粒靶向藥物治療腫瘤整體發展水平還處于基礎階段,還存在許多不足和困難。① 由于病變器官和正常器官生物學行為不同,磁性納米粒靶向藥物應用于具體器官還必須優化藥動力學特征。② 突破磁場強度和梯度的限制,隨著高梯度磁性分離原理[8]的應用,有望克服這一限制。③ 探索利用磁性靶向途徑從基因水平治療腫瘤,提高靶基因轉染的速度和效率[9]。

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Effect of Gemcitabine nano-magnetic targeting capsule on P53 expression in lung cancer

XUEKe-ying,KEMing-yao,WUXue-mei,ZHAONian-gui,LINYan,SHENJie-fang

RespiratoryCenter,theSecondHospitalAffiliatedtoXiamenMedicalCollege,Xiamen,Fujian361021,China

Objective To observe the effect of Gemcitabine nano-magnetic targeting capsule on tumor inhibition rate, blood routine, liver function, renal function and P53 expression in lung cancer cell line A2 of nude mice model, and to explore its curative effect, safety and mechanism of inhibiting tumor. Methods Lung cancer model mice which were injected with lung cancer cell Line A2 were divided into five groups: the NiTi alloy bronchial stent and nano-magnetic targeting drug group, the NiTi alloy stent and chemotherapy group, the nano-magnetic targeting drug group, the chemotherapy group and the untreated group. Thier tumor inhibition rate, blood routine, liver function and renal function were observed. RT-PCR and western blot were used to detect the expression of mRNA and P53 protein. Results The NiTi alloy bronchial stent group and the nano-magnetic targeting drug group had more significant tumor inhibition effect, and less myelosuppression and liver and kidney injury. Compared the with untreated group, the expression of P53 in the NiTi alloy bronchial stent group and the nano-magnetic targeting drug group was decreased significantly (P<0.01). The expression of p53 in the NiTi alloy stent group and the chemotherapy group, the nano-magnetic targeting drug group also decreased (P<0.05). Conclusion Nano-magnetic targeting drug has better curative effect and fewer side effects on lung cancer inhibition of mice, which may attribute to the down regulation of P53.

nano-magnetic targeting drug; gemcitabine; lung cancer; P53

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.02.001

福建省自然科學基金面上項目(No 2011D010)

361021 福建 廈門，廈門醫學院附屬廈門市第二醫院廈門市呼吸中心

2016-02-07]